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1、,结构基因组学,1,基因组学的基本概念、基因组作图与测序的原理和方法。,重点,2,结构基因组学,1、概念和目的 2、基因组作图遗传图谱物理图谱转录图谱序列图谱 3、基因图谱,3,概念和目的,以全基因组测序为目标的基因结构研究弄清基因组中全部基因的位置和结构，为基因功能的研究奠定基础。 其目的是建立高分辨的遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱。 一个生物体基因组的最终图就是它的全部DNA序列,4,结构基因组学主要任务 基因组作图,遗传图谱（连锁图谱） 物理图谱 转录图谱 序列图谱（分子水平的物理图谱）,5,遗传图谱,6,遗传图谱（连锁图谱）,概念：指基因或分子标记在染色体上的相对位置与遗传距离
2、，用厘摩（cM）表示。 cM含义：1cM的遗传距离表示在100个配子中有1个重组子。在哺乳动物中，遗传图谱上1cM的距离大约相当于物理图谱上1000000 bp。,7,用途：通过该图谱可分清各基因或分子标记之间的相对距离与方向，如靠近着丝粒或端粒 注意：该图谱的构建是以位于同一染色体相邻的2个基因或遗传标记的重组率为基础，因而需要有参考家系和分子遗传标记或基因作为研究基础,8,一、遗传图谱与遗传标记,遗传图谱 采用遗传分析的方法将基因或其他DNA序列标定在染色体上构建连锁图。 什么是遗传标记？ 有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。,9,遗传图谱：通过遗传重组所得到的基因线
3、性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标记之间的重组频率,确定它们的相对距离（cM)。 物理图谱：是利用限制性内切酶将染色体切成数个片段，根据重叠序列把片段连接成染色体，确定遗传标记之间物理距离碱基对(bp)或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)的图谱。,10,要构建构建遗传图谱，需要寻找基因组不同位置上的特征标记（遗传标记）。包括：（1）形态标记（2）细胞学标记（3）生化标记（4）DNA分子标记,11,二、标记的多态性,所有的标记都必须具有多态性花色：白色、红色身高：高、矮血型：A、B、O型淀粉：糯、非糯所有多态性都是基因突变的结果！,12,（1）形态标记,形态性状：株高、颜色、白化症等，
4、又称表型标记 控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。 态标记的特征： 数量少 很多突变是致死的 受环境、生育期等因素的影响,13,14,（2）细胞学标记,明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征：染色体的核型染色体的带型染色体的结构变异染色体的数目变异 优点：不受环境影响 缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利,15,（3）生化标记,又称蛋白质标记，就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。如同工酶优点：数量较多，受环境影响小缺点：受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息,16,夏腊梅同工酶谱照片,17,（4）DNA分子标记,简称分子标记，以DNA序列的多
5、态性作为遗传标记 随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、TRS、SNP等多种分子遗传标记检测技术，开创了遗传标记研究的新阶段。优点：不受时间和环境的限制遍布整个基因组，数量无限不影响性状表达自然存在的变异丰富，多态性好共显性，能鉴别纯合体和杂合体,18,遗传作图的标记,Set the flags on the genomes,19,染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标, 路标具有物理属性,他们由特定的DNA顺序组成. 路标位于染色体上的位置是固定的, 不会更改的,因而提供了作图的依据,20,三、分子标记类型,RFLP（第一代）：限制性片段长度多态性 TRS（第二代）：串联重复序列标记 S
6、NP（第三代）：单核苷酸多态性 ,21,1. RFLP的原理,利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小不等、数量不同的分子片段， 酶切位点的改变，会使得RFLP谱带表现出不同程度的多态性.,22,PCRRFLP,将PCR产物术用于RFLP分析，即PCR-RFLP。 该技术先用1对引物特异性扩增基因组的某一高变区，然后用限制性内切酶消化PCR产物，电泳检测多态性。,23,PCRRFLP的应用, CCT GAG GAG , CCT GTG GAG ,Mst酶切位点,Mst酶切位点消失,24,2. TRS,真核生物基因组中的可变串联重复序列 （variable number tandem repe
7、ated sequence， VNTR）有两类:小卫星和微卫星，两者具有高度的变异性。,25,VNTR示意图,1 2 3,VNTR变异的原理示意图,26,DNA指纹图谱原理,选择在VNTR特异序列上没有酶切位点的限制性内切酶将动物总基因组DNA切成不同长度的片段； 以VNTR中特异序列作为探针，进行Southern杂交； 由于不同个体的串联重复序列的数目和位置不同，形成的杂交谱带具有个体的特异性，人们称为DNA指纹图谱。,27,28,3.小卫星 DNA,小卫星重复单位的核心序列为15-76bp 近缘物种和个体间的小卫星核心序列有着一定的同源性，在一定的条件下可以相互杂交。,29,4.微卫星DN
8、A,又称简单序列重复（simple sequence repeat，SSR） 是高度重复序列，广泛存在于真核生物基因组，重复单位的核心序列为2-6bp。,30,微卫星遗传标记的原理,以微卫星DNA标记两侧特异性序列设计专一引物，通过PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，不同个体间因核心序列的重复次数不同而产生DNA多态性,31,微卫星遗传标记示意图,PCR扩增,凝胶电泳,32,5. SNP,是指染色体上的某个存在单个碱基的变化，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等。,33,遗传图谱的构建方法,理论基础: 连锁与交换基本方法: 两点测验法和三点测验法,34,四、遗传图谱
9、的构建,35,遗传图谱构建的步骤,选择适合作图的DNA标记； 根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合； 建立具有合适的分离群体； 测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型 对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图,36,1、亲本的选配首先要考虑亲本间的DNA多态性； 选择亲本时应尽量选用纯度高的材料； 要考虑杂交后代的可育性；,37,2、分离群体大小的选择,一般选用F2代分离群体遗传图谱的分辨率和精度，很大程度上取决于群体大小。群体越大，则作图精度越高。但群体太大，不仅增大实验工作量，而且增加费用。因此确定合适的群体大小是十分必要的。合适群体大小的确定与作图的内容有
10、关。 从作图效率考虑，作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面： 是从随机分离结果可以辨别的最大图距。 是两个标记间可以检测到重组的最小图距。,38,3、图谱构建的理论基础,基因重组和连锁理论遗传图谱构建的理论基础是染色体的交换与重组 基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系在一起 基因的重组是通过一对同源染色体的两个非姊妹染色单体之间的交换来实现的,39,Sh C,sh c,二分体,Sh C,Sh C,Sh C,Sh C,Sh C,sh c,sh c,sh c,sh c,sh c,sh C,Sh c,C Sh,C Sh,C Sh,c Sh,C sh,c sh,c sh
11、,c sh,四分体,全部亲组合占94,3亲组合 3重组合,6%细胞交换,F1,新,新,新,sh c,sh c,Sh C,Sh C,P1,P2,94细胞无交换,40,假设某一对同源染色体上存在Sh-sh ，C- c两对连锁基因，现有两个亲本P1 和P2，它们的基因型分别为ShShCC和shshcc，两亲本杂交产生ShshCc双杂合体。F1在减数分裂过程中应产生4种类型的配子，其中两种为亲型配子ShC和shc，两种为重组型配子Shc和shC。由于Sh-sh和C-c位于同一染色体上，要产生重组型配子必须在这两个基因的连锁区段上发生交换。,41,1、遗传图谱构建原理：基因连锁与互换定律遗传图谱（基因或
12、标记的排序与遗传距离）物理图谱（基因或标记的排序与物理距离）,42,4、重组率的计算 重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发生交换的频率。交换频率越高，则重组型配子的比例越大。 重组型配子数 重组率= 100%总配子数 重组率用于估计交换率，但并不完全等于交换率 只有发生奇数次交换，重组率才等于交换率。,43,重组型配子最大可能的比例是50%，这时在所有减数分裂的细胞中，在两对基因的连锁区段上都发生交换，相当于这两对基因间无连锁，表现为独立遗传。 重组率的高低取决于交换的频率，而两对基因之间的交换频率取决于它们之间的直线距离。 重组率的值变化于完全连锁时的0%到完全独立时的50%之间。因此
13、重组率可用来表示基因间的遗传图距，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。,44,5、图谱制作的统计学原理 （一）两点测验如果两个基因于同一染色体上且相距较近，则在分离后代中通常表现为连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点测验 了解各等位基因分离是否符合孟德尔分离比例，这是连锁检验的前提： 在显性条件下，F2群体中分离比例为3:1,45,（二）多点测验 对多个座位进行联合分析，利用多个座位间的共分离信息来确定它们的排列顺序，也就是多点测验。 在一条染色体上，经过多次多点测验，就能确定出最佳的基因排列顺序，并估计出相邻基因间的遗传图
14、距，从而构建出相应的连锁图。,46,6、构建DNA标记图谱的计算机软件 许多学者为构建遗传图谱设计了专用程序包,通过网址http:/linkage.rockefeller.edu/soft/list.html可以获得各种专用程序的相关信息，。应用于植物遗传连锁分析和遗传图谱构建的常用软件是MAPMAKER/EXP等。 MAPMAKER/EXP可通过 ftp:/ ftp-genome.wi.mit.edu/distri- bution/software/mapmaker3获得，该软件可以应用于各种类型的实验群体进行遗传作图，是目前应用最为广泛的作图软件之一。,47,7、DNA标记连锁图谱的完善,
15、DNA标记连锁群的染色体定位把分子标记所建立的连锁群与经典遗传图谱联系起来，并将其归属到相应的染色体上，是构建了一个比较饱和的分子图谱之后十分重要的工作。通常根据分子标记与已知染色体位置的形态标记的连锁关系来确定分子标记连锁群属于哪条染色体。,48,8、遗传图距与物理距离对应关系的估计不同生物的1cM图距所对应的实际物理距离（碱基对数量）存在很大差异。一般而言，生物越低等或越简单，1cM图距平均对应的碱基对数量就越少,49,分子标记实例1 遗传图绘制-亲本基因型,50,遗传图绘制-F2基因型分析,51,52,遗传图的偏离,大量的细胞遗传学研究表明，染色体的各个区段交换频率有很大的差别： 近端粒
16、区和远着丝粒区有较高的重组率，染色体的某些位点之间比其他位点之间有更高的交换频率，被称为重组热点（recombination hot point） 性别也能引起重组率的差异：一般而言，由女性减数分裂事件绘制的遗传图比男性的要长的多,53,部分连锁与遗传作图,构建遗传图谱的基本原理是真核生物遗传过程中会发生减数分裂，此过程中染色体要进行重组和交换，这种重组和交换的概率会随着染色体上任意两点间相对距离的远近而发生相应的变化。根据概率大小，人们就可以推断出同一条染色体上两点间的相对距离和位置关系。正因为如此，我们得到的这张图谱也就只能显示标记之间的相对距离。我们称这一距离(概率)为遗传距离(cM)，由此构建的图谱也称为遗传图谱。,
