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1、蛋白质组学与生物质谱技术,主要内容,蛋白质组学概念及主要研究内容 蛋白质组学技术基础 蛋白质组学面临的挑战及其对策 蛋白质鉴定的主要策略及技术流程 样品前处理 色谱/电泳分离 质谱分析 数据库检索,Proteome and Proteomics,一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质(PROTEOME = PROTEin + genOME )Proteomics 通过研究蛋白质组揭示基因组序列和细胞行为之间的关系蛋白质组学是发现的科学,是系统生物学的重要组成部分蛋白质的鉴定是蛋白质组学研究的基本问题,Proteomicsn: Proven Thermo Solutions,Protein
2、 IDQuantitationThroughput,MSnPhosphorylationGlycosylation,Intact Protein AnalysisProtein IsoformsBiomarkers,Differential ExpressionLabelsLabel-free,Bottum-up and Top-down,在蛋白质的水平上进行的蛋白质组学研究 理想的蛋白质组学研究模式, 当前技术攻关的热点 技术上存在困难, 近期难以实现通量化 在多肽的水平上进行的蛋白质组学研究 技术相对成熟,是当前蛋白质组学研究的主流 信息不全,蛋白质组学的基础和前提,双向电泳和多维液相色谱
3、技术 生物质谱技术 基因组计划的完成 生物信息学技术,Promise of proteomics,Rodriguez-Ortega et al. Nat Biotechnol. 2006 Feb;24(2):191-7.,蛋白质组的复杂性 vs 蛋白质组学中的分离策略,2DE 在蛋白水平上的分离 2DLC 在多肽水平上的分离,Challenges in proteomics,Look deeper,1 mL,1 L,1 L,1,000 L 或 1 L 起始体积 MS,1 amol LOD,血浆样品起始体积 MS,1 fmol LOD,Albumin,IgG,tissue leaking pro
4、teins,Interleukinscytokines,Fibronectin,Complement C1,10-3/mili,10-6/micro,mol/L,10-9/nano,10-12/pico,10-15/femto,10-18/atto,10-21/zepto,10-24/yocto,InsulinPeptide drugs,5106,5103,ng/mL, average M.W. = 5 kDa,5100,510-3,510-6,510-9,unknowns,Protein drugs,质谱,Science. 2006, Vol 312, 212-217,离子源,EI CI F
5、AB APCI ESI MALDI APPI,Ion Transfer Tube,ESI Needle,+/- 5 kV,Taylor Cone,Solvent evaporation and Ion desolvation,ESI: Electrospray ionization,MALDI:matrix assisted laser desorption ionization,质量分析器,Single quadrupole 单四极杆 Triple quadrupole 三级四极杆 Ion trap 离子阱 TOF 飞行时间 Orbitrap FTICR Q-TOF TOF-TOF Q-tr
6、ap Ion trap-TOF LTQ-Orbitrap LTQ-FT ,裂解方式,CID/CAD 碰撞诱导裂解 PSD 源后裂解 SID/source fragmentation 源内裂解 IRMPD ECD ETD PQD ,Why trypsin?,Trypsin的作用位点在K、R的C-端肽键,专一性很强,水解蛋白产生的多肽(tryptic peptide)多在2-3 kDa,每个蛋白平均约产生50个肽段左右。 Tryptic Peptide在ESI positive mode下离子化效率高 质谱在此质量范围能够准确测量,加上较多的肽段数及很强的专一性,保证了PMF策略鉴定蛋白质的可行性
7、 有效的MS/MS图谱一般来自大小在2-3 kDa 的多肽,且以R、K结尾的多肽裂解充分,有较强的规律性,保证了MS/MS策略的可行性。,PMF vs. MS/MS searching,PMF 可以提供较高的序列覆盖率 多采用2DE-MALDI-MS配置,适用于简单样品 没有序列信息,可靠性差 已经过时 MS/MS 提供序列信息,可靠性高 多采用LC-ESI-MS/MS配置,适用于复杂样品 存在采集时间限制问题 广为接受,Separation power Peak capacities,*measurements per hour,2DE 500 - 10,000 protein spots
8、Affinity Chromatography 2 Ion exchange Chromatography 10 protein level Gelfiltration 10 Reversed Phase Chromatography 50 Ion Exchange Chromatography 25 Reversed Phase Chromatography 100 peptide level 2DLC (IEX/RPC) 2,500 Linear IT MSn 18,000 mph*,Why 2D LC/MS?,可鉴定具有极端pI、疏水性、分子量的蛋白质 适合膜蛋白 重复性好 容易自动化
9、上样量大 高灵敏度(溶液酶切) 可根据样品灵活配置(但最后一维一般为RP),Then why SCX/RP/MS?,SCX和RP的分离原理是互补的 SCX按荷电情况,PR按疏水性 流动相是兼容的 pH3,ACN/water/salt SCX流动相中的盐可以在RP时有效去除 Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留 Tryptic peptides在SCX条件下是稳定的,Copyright 2004 by the National Academy of Sciences,Beausoleil, Sean A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sc
10、i. USA 101, 12130-12135,Fig. 1. Scheme for phosphopeptide enrichment by SCX chromatography,Gel,Gel spot,Proteolytic peptides,Mixture of Proteins,Digestion,Proteolytic peptides,Digestion,LC,Protein Identification Workflows,Peak Finding,Peak list,Search of a Sequence Collection,Identified and Proteins
11、,Protein Candidates,Significance Testing,Protein Function?,Sequence Similarity Search,样品的前处理,Very important process (VIP)! 样品的损失 吸附 样品的污染 角蛋白 酶切不充分 溶液酶切和胶内酶切 ,How many peptides have we lost?,The spectrum of fraction 108 after deletion of ACN by N2 flow.,The spectrum of the ACN elute of the tube of f
12、raction 108 after deletion of ACN by N2 flow.,The spectrum of fraction 108 after deletion of ACN by N2 flow and ZipTip erichment.,回收率和 操作步骤多少的关系 Keep it simple!,Total no. of steps,Overall % recovery,100 % recovery/step,90 %,80 %,70 %,60 %,50 %,MudPIT Multi dimensional Protein Identification Technolo
13、gy,在Yates 发表关于MudPIT 的文章的许多年前就有人发表关于2D LC的文章。但是Yates第一个将2D LC用于蛋白质组学并引起学术界的广泛关注。此后,各种各样的类似2D LC方法应运而生,其中有一些方法得到广泛接受和应用。,2DLC 2-dimensional liquid chromatography,MDLC Multi Dimensional Liquid Chromatography,RPC,IEX,RPC trap,RPC trap,on-line elution by salt plugs to trap column,IEX,off-line gradient e
14、lution with “classical” fraction collection,RPC,2D LC的三种配置形式,IEX,RPC,in-line MudPIT,MudPIT,SCX,RPC,优点 构造简单 SCX 和 RPC 填料在同一个柱子里 自己装柱,成本较底,缺点 方法和柱子没有商业化 SCX和RPC都不在最佳状态 必须得用挥发性缓冲体系 由于需要很长的平衡时间,因而费时,on-line 2D-LC,优点 全自动 样品体积可根据后续RPC调整 在线脱盐、浓缩 自由选择缓冲盐,缺点 SCX峰容量有限 ACN浓度在IEX和RPC得一致 两相分离都没能在最佳状态下进行,off-line
15、 SCX with fraction collection,优点 两维分离都有可能在最佳状态下进行,得到最好分辨率和峰容量 可自由选择缓冲体系 样品体积可根据后续RPC调整 速度快(只需一个SCX操作) SCX馏份可留待以后分析,缺点 自动化程度低,off-line SCX 的典型结果,Column: Mini S PC 3.2/30, NPR, 3 m Eluent A: 0.065% TFA in 30%ACN Eluent B: 500 mM KCl in Eluent A Typical peak width: ca. 10 s,The secret behind sensitivit
16、y Reducing column dimensions,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,off-line 2D LC的典型实验条件,1. Dimension (SCX) Column: SCX 5 um, 50 x 0.32mm Eluent A: 20 mM Citrat 25, % acetonitrile, pH 2.65 Eluent B: 500 mM NH4Cl in Eluent A, pH 2.65 Flow rate: 4 l/min Gradient: 0 bis 100 % B in 30 to 60 min2. Dimension (RPC) Trap-column: C18, 5 um, 5 x 0.3mm Column: C18, 3.5 um, 150 x 0.075mm Eluent A: 0.1% formic acid Eluent B: 0.1% formic acid in 84% acetonitrile Flow rate: 200 nl/min Gradient: 0.25 to 1% acetonitrile/min,