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1、单击此处编辑母版标 题样式单击此处编辑母版副标题样式*1基因工程田长恩Tel: 13342886615苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务 基因工程1 基因工程概论2 天然DNA的制备3 分子克隆工具酶4 分子克隆载体 5 表达载体 6 PCR技术及其应用 7 目的基因的制备8 基因克隆的筛选策略 9 细菌基因工程 10 酵母基因工程 11 植物基因工程 12 动物基因工程 13 医药基因工程 14 基因工程的安全苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务 How to amp
2、lify a target gene ?苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务 Amplification of a target gene with PCR if the sequence is known.苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务7 目的基因的制备7.1 直接分离7.2 构建基因组文库分离7.3 构建cDNA基因文库分离 7.4 利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因 7.5 基因的化学合成(自学)苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务
3、型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务7.1 直接分离1) 限制酶酶切分离法适于从简单基因组分离目的基因，如质粒和病毒。对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段即可。对定位的目的基因，根据目的基因两侧的已知限制酶识别 位点，用适当酶切割，可获得目的基因。即使含目的基因的DNA分子未定序或未定位，先通过酶切 分析，随后再通过部分酶切，克隆构建一个非常简单的基因 组文库，从中钓出目的基因。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务 2）物理化学法如果不同DNA片段的碱基组成差异较大，其理化性
4、质，如浮 力密度和解链温度等明显不同，采用相应的方法从生物基因组分离 目的基因。 主要有密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等 。密度梯度离心法：GC含量高，浮力密度大，可用密度梯度 超速离心使片段分开。然后通过与标记的mRNA杂交检验，分离基 因，如非洲爪蟾rDNA和海胆组蛋白基因。单链酶解法：GC含量高，Tm值就高。据此，可通过控制Tm 使富AT区变性解链，而富GC区仍维持双链状态，然后利用单链核 酸酶S1酶切除单链，得到富GC的片段，经梯度离心分离。海胆 rDNA分子内GC含量高达 63，就是用此法分离得到。分子杂交法：单链DNA与其互补的序列 “配对成双” 后，再 将非单链用单链核酸
5、酶 S1切掉，最后经梯度离心分离。Beckwith (1969)等应用此法，成功地分离了大肠杆菌乳糖操纵子的-半乳糖 苷酶基因，首创了单基因分离的成功先例。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务 3）双抗体免疫法此法适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质。黄色葡萄球菌中的 protein A可以同IgG产生免疫反应而代替 第二抗体，由此发展出用protein A -Sepharose 4B作为亲和层析介 质，通过亲和层析分离特定的多聚核糖体的技术，从而使双抗免 疫法更有效。多聚核糖 体制备与一抗 保温多聚核糖 体-一抗特定 mRN
6、A不连续蔗糖梯 度离心多聚核糖 体-一抗体 -二抗纯化的多聚 核糖体-一抗 体-二抗去除蛋白cDNA苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务4) 反转录法对于特定基因，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成 cDNA，然后在 DNA聚合酶的催化下合成双链 cDNA片段。这样就可以通过mRNA-cDNA-dscDNA的途径而绕过建立cDNA文库这一步，直接得到基因。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务7.2 构建基因组文库分离法(第11章)高等生物的基因组DNA十分庞大，可达
7、数万个，且基 因组成结构复杂，因此，单个基因在整个基因组中所占的 比例极小，除少数外，绝大多数基因难以直接分离。解决以上难题的一种可行方法就是扩增这个基因，以增加分离成功的可能性。但要分离的目的基因往往是未知基因，无法进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再用不同的方法将所需的克隆筛选出来，再分离得到目的基因。单击此处编辑母版标 题样式单击此处编辑母版副标题样式*11鸟枪法克隆目的基因早期方法，先将DNA 打断，与适当载体重组， 转化受体菌进行无性繁殖 ，获得一大群含不同外源 DNA片段的克隆，再从众 多的转化菌株中筛选出含 有某一目的基因的菌株，
8、获得所要的基因。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务鸟枪法的不足：采用质粒作载体，克隆能力有限，重组后的克隆多，筛选困难。噬菌体载体使可插入的外源片段长度大为增加，最大可达22 kb；而cosmid和YAC载体能容纳45 kb和上百万kb，有利于分离和筛选同一生物体内的各种基因片段。1) 基因组文库的概念通过克隆载体使某种生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受体菌的群体，即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目
9、路演文档企业文化建设操作实务2）基因组文库的大小理想的基因组文库：“全”，克隆群体包含基因组的所有DNA序列；“完整”， 片段的长度要足够，含基因的完整序列，包括其侧翼序列； “重叠”，目的序列在某些克隆中有部分重叠，便于获得基因的全部序列。一般情况下，完整的基因组文库所需的克隆总数取决于外源基因组大小及切割片段大小，可用公式进行理论值的估算：苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长片段均长例如某生物基因组的总长为3106kb，酶切片段均长15kb， 则基因组文库应含克隆子数为 310615 210
10、5。但实际上, 该基 因组文库应含的克隆子数远远超过这个数。为此，Clark和Carbon (1976)提出了一个经验公式用于估算基因组文库的大小，公式如下 ： 必需的克隆的数目 N ln(1-P)/ln(1-f)P：目的片段在文库中出现的概率；f：插入片段大小/全基因 组大小。如果要使文库中目的片段的出现概率达到期望值 99， 即0. 99，则构建上述某生物的基因组文库应包含的克隆子经验值 是 N ln（1- 0.99）ln（1-153106 ），比理论值约大 4.5倍 。几类生物基因组文库大小列于表4-1。实际上，无论采用什么方法都不能达到理论上的完全随机 切割。为了使基因组文库具有真实代
11、表性，一般构建基因组文 库的实际克隆数应比上述计算值大2倍或3倍，甚至更高。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务3）构建噬菌体基因组文库包括获得含基因的DNA片段，与噬菌体克隆载体重组，转化受体菌和筛选克隆子。目前较多地选用替代型噬菌体载体来构建基因组文库，其基本步骤如图所示。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务BmaHI与Sau3AI是同尾酶 （5GATC）I苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务4) 构建co
12、smid基因组文库Cosmid分子小，含质粒复制起点和抗生素标记，可在大肠杆菌中复制；也含cos位点，可体外包装。重组Cosmid进入大肠杆菌后，只按质粒DNA的方式复制，所得为菌落。Cosmid作为构建基因组文库载体的优缺点优点：能容纳更大的片段（3045 kb）；载体分子很小（5 kb），便于插入片段的限制酶图谱分析。缺点：筛选困难；重组效率低； 文库不易贮存。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务 5) 构建YAC基因组文库噬菌体和cosmid克隆能力约为20和45 kb，对于单个基因或小基因组已足够，但对于大基因组明显不够。酵
13、母人工染色体（yeast artificial chromosome， YAC）能象染色体一样在酵母细胞中复制，并可克隆长达上千kb的DNA。YAC以pBR322为骨架，具pBR322质粒的复制起点和筛选标记，还加入染色体复制必需的组分：着丝粒序列（CEN）、酵母自主复制序列（autonomusly replicating sequence，ARS）、一对端粒序列（TEL）、选择标记TRP1和URA3 (酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型trp1和ura3的野生型等位基因)、克隆位点，存在于SUP4中。当外源DNA片段插入时，该基因被隔断，使突变宿主菌落由白色转为红色。构建过程如图。丢失苏教版初三语
14、文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务7.3 构建cDNA基因文库分离(第11章)基因组庞大而复杂，从染色体DNA出发，直接克隆目的基因非常困难。 高等生物具有大约104-5种基因，但在一定发育阶段的单个细胞或个体中，仅15左右的基因表达。可见由 mRNA出发反转录而产生的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA克隆是通过酶将总poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体，插入到适当载体后转化寄主，构成某个时期或某组织中 表达基因的 cDNA基因文库（图）。7.3.1 cDNA文库的构建（i）先提总RNA，再纯化mRNA。
15、苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务（ii）合成第一链cDNA。Oligo(dT)引导的cDNA合成法: 用12 20个Oligo(dT)做引物, 以mRNA为模板合成第一链cDNA，得 RNA-DNA杂交分子。但是，此法从3-端开始，往往无法到达5- 端。随机引物引导的cDNA合成法: 利用随机610个核苷酸（混合物）为引物，从许多位点同时反转录，然后测序和重叠分析， 得到mRNA全序列。（iii）将mRNA-DNA转变为双链DNA。
16、大肠杆菌RNaseH酶识 别mRNA-DNA，并将其mRNA消化成许多短片段，仍同第I链 DNA杂交着，故可作为引物，以第I链为模板合成第II链。最后，用连接酶连接。 （iv）将合成的双链cDNA重组到载体上，导入寄主增殖。苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务以质粒为载体构建cDNA文库苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务PCR法合成cDNA苏教版初三语文广告多棱镜专题课件证券投资的技术分析理论服务型机器人项目路演文档企业文化建设操作实务7.3.2 mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系一个细胞中有上万种mRNA，但各种mRNA的拷贝数不同， 即丰度不同, 可以分为高、中和低丰度类型(表)。苏教版初三语文广告
