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1、生物分析化学一.氨基酸结构1.定义 分子中含有氨基和羧基的化合物,叫做氨基酸至少含一个羧基(COOH),一个氨基(-NH2)的小分子量( 100200)有机物。是存在于动植物体内的必要物质。氨基酸 2.氨基酸的命名 n氨基酸的系统命名方法与羧基酸一样天然氨基酸常根据其来源或性质多用俗名。例如甘氨酸是由于它具有甜味而得名。甘氨酸(-氨基乙酸 ) 由蛋白质水解所得到的-氨基酸,可 用通式表示如下:3.氨基酸的手性异构体n除甘氨酸外,由于-氨基酸中-C上四个 取代基不同,为手性C,因此-氨基酸有左 旋(L)和右旋(D)二种手性异构体n蛋白质经温和水解后,其中的-氨基酸都 是L型氨基酸.n自然界中,存
2、在有D型氨基酸.n人工合成氨基酸为 DL等mol混合物。(-氨基乙酸)4.-氨基酸的分类 n-氨基酸可分四类: n带电荷的侧链 不带电的 极性侧链非极性脂肪烃侧链 芳香族侧链 二.氨基酸的性质 n-氨基酸都是无色晶体,熔点一般都较高(常 在230-300之间),熔融时即分解放出二氧化碳 。n-氨基酸都能溶于酸性或碱性溶液中,但难溶 于乙醚等有机溶剂。在纯水中各种氨基酸的溶解度 差异较大,加乙醇能使许多氨基酸从水溶液中沉淀 析出。n氨基酸分子内既含有氨基又含有羧基,因此它们 具有氨基和羧基的典型性质。由于两种官能团在分 子内的相互影响,又具有一些特殊的性质。两性氨基酸分子中既有碱性-NH2和酸性
3、-COOH, 与强酸或强碱都能作用生成盐,因此氨基酸 为两性化合物。等电点 若将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当调节,可 使羧基与氨基的电离程度相等,也就是氨基酸 带有正、负电荷数目恰好相同,此时溶液的PH 值称为该氨基酸的等电点. 两性离子通以直流电, 当PHPI 主要以阴离子存在,向阳极移动; 若PHPI 主要以阳离子存在,向阳极移动; 如果PHPI,则不发生电泳,氨基酸主要以两 性离子存在,其净电荷为零谷氨酸 3.22丙氨酸 6.02缬氨酸 5.96亮氨酸 5.98异亮氨酸 6.02脯氨酸 6.30苯丙氨酸 5.48色氨酸 5.89精氨酸 10.76等电点脱水生成肽两分子-氨基酸(相同或不同
4、)脱去一分子水,缩合成 为一个简单的肽,即二肽。二肽分子中含有的酰胺键叫做 肽键。二肽分子中的末端仍含有自由的氨基和羧基,因此还 可以继续与氨基酸缩合成为三肽、四肽以至多肽。多肽 脱羧作用某些氨基酸在一定条件下,可脱去羧基 ,生成相应的胺。与亚硝酸的反应氨基酸中的氨基具有伯胺的性质,与亚硝酸 作用时生成羟基酸,同时定量的放出氮气。量气法测氨基酸的基础与茚三酮的显色反应 -氨基酸与茚三酮的水合物在水溶液中加热时, 生成蓝紫色或紫色化合物,同时产生醛、二氧化碳 和氨。这个反应非常灵敏,是鉴定氨基酸最迅速、 最简单的方法,常用于-氨基酸的比色测定或纸 层析、薄层层析时的显色。 三氨基酸分离分析方法原
5、因:氨基酸种类多结构较相似 不经分离,难以直接分析分离方法高分辨分离技术:纸、薄层色谱电泳气相色谱高效液相色谱一、纸色谱1.固定相纸色谱滤纸2.流动相 多种组合配比常用 酚水(160g:40ml)丁醇醋酸水(12:3:5)分离方式: 一维色谱分离 二维色谱分离,为获得高分辨率二维色谱分离横坐标:酚水纵坐标:丁醇 HAc水分离效率高显色定位 茚三酮 (兰紫色产物) 2,4二硝基氯苯 FDNB + AAsDNP-氨基酸(黄色)一维色谱分离纸层析分离20种氨基酸先用酚-水(7:3)展开剂再用丁醇-醋酸-水(4:1:2)二次展开离子交换色谱法阳离子交换剂为柱填料 洗脱液Na+型缓冲液能很好的分离各种蛋
6、白水解氨基酸 ,却不能将天门冬酰胺、谷氨酰胺和一些相关的 氨基酸分离开来通过改换Li+ 缓冲液体系可分离。衍生与检测 多数氨基酸没有生色基团,因此在紫外可见光区无 吸收(在常规蛋白水解氨酸中只有苯丙氨酸,酪 氨酸 和色氨酸三个有紫外吸收),必须将之衍生 、转化为具有紫外可见光吸收或能产生荧光的物质 才能检测分析。 常用的衍生法 茚三酮法:经色谱柱分离的氨基酸与茚三酮溶液混 合、加热后,多数a一氨基酸可与茚三酮反应生成 兰紫色的化合物,其最大吸收波长为570nm,a一氨 基酸与茚三酮的反应方程式如下: (b)邻苯二甲醛(OPA)法:氨基酸分离后也可与邻苯二 甲醛混合,在常温、乙硫醇或-巯基乙醇存
7、在下产生一种 强荧光衍生物。即; 可在340 nm激发光下,于455nm处侧 定其发射之荧光。该法的灵敏度约为茚三酮法的10倍。 570nm 测A 反相分配色谱氨基酸分析 基本原理:氨基酸属带异电荷的可电离化合物 ,它在反相柱上与固定相相互作用很弱,因此 必需通过柱前衍生使氨基酸变成带疏水基团的 衍生物,一则获得可分离性,二则获得可检测 的光学特性。 先将氨基酸进行柱前衍生,使之与带有疏水基 团的衍生剂反应生成利于在反相柱上保留、分 辨的化合物,经柱分离后,再根据衍生物的光 学特性选择相应的检测器进行检测、定性与定 量。目前国内外应用最广、影响最大的柱前衍生剂有 邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸
8、苯酯(PITC)、 二硝基氯苯(PDNB)和二甲基氨基偶氮苯磺酞氯 等。 分离与检测衍生后的氨基酸一般在高效C18或C8柱上, 根据液液分配原理进行分离。流动相多以乙酸盐 或磷酸盐缓冲液为主,以乙睛、甲醇或四氢呋喃 为调节剂。由于氨基酸衍生物仍保留着两性化合 物的特点,故除改变调节剂的比例外,还可通过 调节缓冲液pH值,离子强度、柱温等使之达到理 想的分离 异硫氰酸苯酯邻苯二甲醛蛋白质结构的复杂性n分子中含有 100多个氨基酸的残基n具有特定的构型n可分为四级结构蛋白质的四级结构n一级结构 氨基酸在蛋白质链中的顺序n氨基酸在-羧基通过酰胺键与下一个氨基酸的- 氨基间共价结合,在蛋白质中通常称为
9、肽键。一 碳原子和肽键的重复序列构成了多肽的骨架,而不 同的氨基酸侧链授与蛋白质的功能。在多肽的一端 的氨基酸有一个未结合的-氨基,而另一端有一 个自由的-羧基。因此,多肽是有方向性的,有 一个N端和一个C端。有时N端被像乙酰基这样的基 团封闭。从N端到C端的氨基酸顺序就是多肽的一级 结构。典型的单个肽链的大小在100-1500个氨基酸 之内.脱水生成肽 两分子-氨基酸(相同或不同)脱去一分子水,缩合 成为一个简单的肽,即二肽。二肽分子中含有的酰胺键 叫做肽键。二肽分子中的末其端仍含有自由的氨基和羧基,因此 还可以继续与氨基酸缩合成为三肽、四肽以至多肽。多肽 二级结构每个肽的NH 基团都与相距
10、3个残基的 CO 基团间形成氢键二级结构由肽链中的氢键力形成. -螺旋。右手螺旋 ,每个肽的NH 基团都与相距3个残基的CO 基团间形成氢 键。 如球蛋白和一些纤维蛋白 -折叠片层是由肽键N-H 和CO基团与肽链上另 一段互补的基团间以氢 键维系的。形成一个带 侧链 (R)的片层结构 ,侧链突出于片层的上 面或下面。-折叠坚硬 牢固,是重要的结构蛋 白,如丝蛋白。-螺旋和-折叠三级结构不同片段-螺旋、-折 叠、其他微二级结构和 连接环进一步折叠成三 维构象,即多肽的三级 结构 带有亲水侧链的氨基酸位于蛋 白质外部,可与水或溶剂离子 反应、而疏水氨基酸被埋在疏 水的内部,这使得结构总体上 稳定。
11、侧链间各种类型非共价 相互作用维系着三级结构,这 相互作用包括范德华力、氢键 、带相反电荷基团之间静电力 (如赖氨酸-NH3+基团和天冬 氨酸或谷氨酸侧链COO-基因之 间)以及存在于芳香族和脂肪 族氨基酸非极性侧链间的疏水 相互作用。共价二硫键可以在 两个半胱氨酸残基间形成。 半胱氨酸谷氨酸 Glu 丙氨酸 Ala 缬氨酸 Val 亮氨酸 Leu 异亮氨酸 Ile 脯氨酸 Pro 苯丙氨酸 Phe 色氨酸 Trp 精氨酸 Arg 半胱氨酸 Cys四级结构四级结构是多个肽链构成.n有特定的功能,例如血红蛋白.n四级结构是由蛋白间的氢键、带相反电荷基团之 间静电力,二硫键以及存在于芳香族和脂肪族
12、氨基 酸非极性侧链间的疏水相互作用而连接在一起.蛋白质质的性质两性电解质酸碱活性基团: 亚胺基pH=0-14 无明显酸碱性质 N端残基 -NH2 C端残基 -COOH R1、R2、R3COOH: 谷氨酸-CH2CH2COOH Glu 天冬氨酸-CH2COOH AspR1、R2、R3NH2:赖氨酸 -CH2CH2CH2CH2NH2(Lys)精氨酸-CH2CH2CH2C(NH)NH2(Arg) 组氨酸(His)等电点pI在某pH,蛋白分子表观电荷为0, 不同蛋白质,等电点不同,蛋白分离的重要 依据大分子性质 分子量 数千数百万, 达千万 分子大小,如分子量3.4万球状4.3nm, 胶体1-100n
13、m, 蛋白质亲水基在外,带电荷,亲水胶体, 表面水化层与电荷使其不致凝集性质扩散速度慢,可以用离心分离粘度大不能透过半透膜,可利用渗析分离变性理、化、生性质改变蛋白质空间构象(二、三、四级结构)破坏不发生肽链的断裂 (范德华力、氢键、静电力疏水相互作用力较 小,在一定的条件下被破坏)分类:可逆变性不可逆变性引起蛋白质变性的因素Heat 如煮鸡蛋 ,使氢键断裂npH 改变蛋白中功能团的电荷和它们间的静电引力 At pH 2 羧基基团不再电离. At pH 12 amino groups are not charged.nH-bonding agents Examples: urea, guani
14、dine 使蛋白中氢键断裂n高盐或低盐浓度 改变静电引力, 如点豆腐 n非极性溶剂 改变亲酯性基团间的作用力n表面活性剂 改变亲酯性基团间的作用力n氧化剂与还原剂 可以改变蛋白中的二硫键强氧化剂与还原剂n强氧化剂与还原剂能改变蛋白中R的性质nThe other R groups that are most easily oxidized next to sulhydryl groups are: phenol (tyrosine酪氨酸), hydroxyl 丝氨酸苏氨酸 Amine 赖氨酸精氨酸组氨酸 甲硫氨酸蛋白质的提取n大多数蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的 水溶液。部分与脂类结合的蛋白
15、质可溶于乙醇 、丙酮和丁醇等有机溶剂中。n1.水溶液提取n稀盐(0.15mol/L)和缓冲溶液对蛋白质溶解度 大,稳定性好,是常用的蛋白质提取液.5C以 下操作,防止热变性.n同时加蛋白质水解酶抑制剂-碘乙酸n控制pH在等电点附近.n2.有机溶剂提取n与脂类结合的蛋白质,分子中含有非极性侧链 的蛋白质不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶 液,但可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中 。n3.表面活性剂提取n用非离子型表面活性剂可以提取水盐系列无法 提取的蛋白质和酶,但随后分离困难,因小心使 用.蛋白质纯化以上介绍的是蛋白方法,如测单一结构蛋白,则 必须分离纯化。 为了研究某一个蛋白质的结构,必须首先将该蛋 蛋白质 从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出 来。用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷 、疏水性和对其他分子的亲和性。通常采用多种 方法的组合来实现蛋白质的完全纯化 .1.按蛋白质溶解不同进行初步分离n1. 等电沉淀和盐析分离法n蛋白质在水溶液中一般以离子态溶于水,在等电 点时电荷为零,此时蛋白质沉淀析出.不同的蛋 白质等电点不同,据此可对蛋白质提取物进行初 步分离.n2.盐溶和盐析n蛋白质水溶液加入盐的浓度对蛋白质的溶解度 有显著影响. 低浓度的盐能增加对蛋白质的