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1、生物化学实验实验一 糖类的定量测定 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法 一、实验目的 1掌握3，5一二硝基水杨酸法定糖的原理及方法。2用3，5一二硝基水杨酸比色法测定山芋粉 中总糖。3熟悉分光光度计的原理及使用方法。 二、实验原理糖类的测定方法有物理方法和化学方法两类。由于化学方法比较准确，常常使用之。还原糖的测定 是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基和酮 基的糖类。 3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕 红色的氨基化合物，在一定范围内，棕红色物质颜色 的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以利 用比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。该法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质
2、干 扰较少。三、实验操作（一）样品中总糖的水解及提取 准确称取山芋粉 1g，放入小三角烧瓶中，加入10ml6N HCL和15ml蒸 馏水，混匀。在沸水浴加热30min后，用KI-I2溶液检 查水解程度。若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后 加入酚酞试剂一滴，以10%NaOH中和至溶液呈微红 色。过滤并定容至100ml。再精确吸取上述溶液10ml ，放入100ml容量瓶，稀释到刻度，备用。（二）葡萄糖标准曲线的制作，取7支大试管分别按表 1-1顺序加入各种试剂。表1-1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量项目 空白 123456含糖总量（mg） 00.40.60.81.01.21.4 葡萄糖液（ml）
3、 00.40.60.81.01.21.4蒸馏水（ml） 2.01.61.41.21.00.80.6DNS试剂(m1) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加热 均在沸水浴中加热5min 冷却 立即用流动冷水冷却 蒸馏水(ml) 21.5 21.5 21.521.521.521.5 21.5光密度(O.D520) 将以上各管溶液混匀后，用分光光度计 (520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点， 记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度 为纵坐标，绘制出标准曲线。一大组同学做一个 标准曲线（三）样品中含糖量的测定 取4支大试管，分别按表12加入各种试剂。 表12测定样品中
4、含糖量时各试剂的用量项目 空白 123样品量（ml） 01.01.01.0 蒸馏水（ml） 2.01.01.01.0DNS试剂(m1) 1.5 1.5 1.5 1.5 加热 均在沸水浴中加热5min 冷却 立即用流动冷水冷却 蒸馏水(ml) 21.5 21.5 21.521.5光密度(O.D520) 将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操 作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的 总糖含量，按下述公式计算出山芋粉总糖百分含 量。总糖=（水解后还原mg数样品稀释倍数100 ）/样品重量四、实验要求1.实验过程中所有的试管要干净，加入各种试剂量要准 确。2.试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取
5、，用后盖 好瓶塞，防回原处。3.分光光度计使用：溶液不要倒太多；毛边不要对着透 光处；用后用自来水冲洗干净，防回原处。4.移液管使用：有色看外边缘，无色看中间凹处。5.实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、试剂 瓶等，以防试剂污染仪器。6.每组同学离开实验室时，须经实验老师检查并同意后 ，方可离开。7.值日生打扫干净实验室后，方可离开。实验二 纸层析法分析氨基酸 一、实验目的 1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。 二、实验原理纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性 支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸
6、、 糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法 。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好 ，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应 用于科研和生产分析工作中。 纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂； 水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶 剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤 纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机 溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相， 有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两 相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配 较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分 配较多，移动相对较慢，
7、从而将极性不同的物质分开。 一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf 值。 Rf值的定义为： Rf =(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶 剂前沿的距离） 影响Rf值的因素有：物质本身的化学结构；展层所用溶剂系统；展层剂pH值；展层时的温度；展层所用滤纸；展层的方向(横向，上行或下行)。 用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相 比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物 质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。三、实验操作 1纸的处理取18 cm长、18 cm宽的滤纸一张，离底边2 cm处用铅笔 轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原 点)划圈，使圈的直径小于0.5 cm
8、。 2点样在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写M ），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内， 待晾干或用冷风吹干后再点1次。每个样品共点2次。3层析将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一 端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图1)。将培养皿中放入23量的展层剂，放入层析缸中，然后将 滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切勿使 展层剂浸到样品点，开始层析。当溶剂前沿到达离上端2 cm处，取出滤纸，用铅笔描出溶 剂前沿，晾干。图1. 滤纸的缝合4显色用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，晾干后 ，将滤纸放入烘箱中(80-100)，烘烤5分钟后
9、，滤 纸上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点 轮廓(见图2)四.结果处理 用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前 沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。图2.层析谱 1原点；2层析点；3溶剂前沿五、实验建议(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘 ，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑 点。 (2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。(3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前 沿。(4) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm） ，防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高 ，否则斑点变黄。(5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳一、实验目的1
10、.学习醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理。2.了解醋酸纤维素薄膜电泳的操作技术。3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。二、实验原理醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持 物的电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形 成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿 、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均匀的薄膜则成为 醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，有强 渗透性，对分子移动无阻力，厚度为120um。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清 蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、一球蛋白 、一球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨 基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同 ，
11、在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低， 在相同碱性pH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗 粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维薄膜为 支持物，正常人血清在pH86的缓冲体系中电泳1 h 左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其 余依次为1-、2-、-、-球蛋白。这些区带经 洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收 扫描，自动绘出区带吸收峰及相对百分比，临床医 学常用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现 作为临床鉴别诊断的依据。 三、实验操作（一）仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择2.电泳槽的准备 在两个电极槽中，各倒人等体 积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上各放
12、 两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐 ，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿 后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐 气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条 是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称 为滤纸桥。3.电极槽的平衡 （二）点样用竹夹子取出薄膜，将无光泽面向上平放 在滤纸上。点样区距阴极端1.5 cm处，点样时 ，先用玻璃棒取血清，均匀涂在点样器表面( 该点样器是由载玻片一端磨成具有斜面而成 ，再将点样器轻轻印在点样区内，如图所示， 使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗 细均匀的直线。此步是实验的关键，是获得具 有清晰区带的电泳图谱的重要环节。 图31 醋酸
13、纤维素薄膜规格及点样位置示意图虚线处为点样位置（三）电泳 先恒流，后恒压用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的 滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上( 如图所示)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下 垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相 隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。 用导线 将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注 意不要接错，在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪 上细调节旋钮调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄 膜则为4.8mA）通电1015 min，将电压调节到90110 V，电泳时间5060min。电泳后调节旋钮电流为O，关
14、 闭电泳仪切断电源。图3一2 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白；2，3，4，5分别为1-，2-，-及-球蛋白；6为点样原点此法由于操作简单快速、分辨率高及重复性好等优点， 目前已成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于 分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶 的分离测定。（四）染色和漂洗电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色 液中，染色5 min，然后取出，先用自来水冲 洗，再用漂洗液漂洗，连续更换3次漂洗液， 可使颜色脱去，得到色带清晰的电泳图谱。（五）透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2 min，取出立即放入透明乙液中浸泡1 min， 取出后立即紧贴于干净玻璃板上
15、，两者间不 能有气泡。510 min薄膜完全透明。若透 明太慢可用透明乙液少许在薄膜表面淋洗一 次，垂直放置，待其自然干燥或用吹风机冷 风吹干且无酸味，再将玻璃板放在流动的自 来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片 撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取 下，用滤纸吸干所有的水分，压干。此薄膜 透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描 。长期保存不褪色。四、实验建议(1)醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜 均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之 一。为防止指纹污染，取膜时应戴指套或用夹子。所 选薄膜应厚薄均匀，否则应弃去不用，以免造成电泳 区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难
16、以重复 。由于薄膜吸水性比纸小，浸泡30 min以上是保证膜 片上有一定量缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状 结构，最好让薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将 膜片上聚集的小泡赶走。点样时薄膜上的缓冲液不宜 太多，但也不能太干。(2)缓冲液的选择 本实验常用的pH86巴比妥缓冲 液，其浓度为005O09 molL。选用何种浓度与 样品及薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳 动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区 带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。(3)加样量 加样品量的多少与电泳条件、样品性质 、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原 则，检测方法越灵敏，加样量越少，对分离更有利。 如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至相互 干扰，染色也较费时。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印 章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，
