蛋白质的分离与纯化

《蛋白质的分离与纯化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的分离与纯化（94页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第九节蛋白质蛋白质 的分离与纯化的分离与纯化一、 引言二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶）分离 与纯化四、层析技术五、电泳技术六、离心技术四、层析技术 层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家 Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶 子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色 素以不同的速率流动后形成不同的色带而被 分开，由此得名为“色谱法”（ Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 1944年出现纸层析。 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、 高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶 层析等。（一）层析的分类 按层析的分离机理分类

2、 排阻层析(exclusion chromatography) 离子交换层析(ion exchange chromatography) 吸附层析(absorption chromatography) 分配层析(partition chromatography) 亲和层析(affinity chromatography) 金属螯合层析(metal chelating chromatography) 疏水层析(hydrophobic chromatography) 反向层析(reverse phase chromatography) 聚焦层析(focusing chromatography) 灌注

3、层析(perfusion chromatography)（二）排阻层析 （凝胶层析）凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行 层析分离的方法，均称之为排阻层析。 用于层析的分离介质称为排阻层析介质。 凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙 烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析 介质。目前已成为生物化学、分子生物学和 生物制药在研究和生产中必不可少的分离介 质。 1、凝胶层析的特点及应用 特点：设备简单、操作方便、样品 回收率高、实验重复性好、特别是 不改变样品生物学活性等优点。 用途：蛋白质(包括酶)、核酸、多 糖等生物分子的分离纯化，同时还 应用于蛋白质分子量的测定、脱盐 、样品浓缩等。

4、2、凝胶层析的原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝 胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多 孔穴。 概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过 装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同 而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混 合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入 凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最 先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由 出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度 较慢，最后被洗脱出来。3. 凝胶的种类和性质(1)交联葡聚糖凝胶（Sephadex)1) Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。

5、G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。2） SephadeX LH20，是Sephadex G25的羧丙基衍生物，溶 于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。 (2)琼脂糖凝胶（Sepharose ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结 构越密集。 (3)聚丙烯酰胺一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交 联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶P（Bio-Gel P). (4) 聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性品 名干胶颗 粒 直径/

6、m得水值 Wf/g.g-1床体 积 /mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需 时间/h最大流体 静力压 /Pa (cmH2O)球蛋白分 子质量Da线性葡聚糖 分子质量 /Da20lOO Sephadex G-1O40-1201.00.12-3700700319810(100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)SephadexG-25粗 中粗 细 超细100-300 50-150 20-80 10-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)SephadexG-50粗 中粗 细 超细100-300

7、 50-150 20-80 10-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗 超细40-120 10-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100中粗 超细40-120 10-4010l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗 超细40-120 10-40151.520-305000-4000001000-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗 超细40-1

8、20 10-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)4. 层析柱的重要参数 柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从 柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色 谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因 引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示 。 外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙， 这部分体积称外水体积，亦称间隙体积 ，常用Vo表示。 内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒 内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分 间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用 Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。 峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所 需洗脱液的体积，常用Ve 表

9、示。 当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较 可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶 位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱 体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样 品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗 脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高 的弯曲点（或半高处）。 洗脱体积5. 凝胶过滤在试验室中的应用1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）分级分离 4）溶液浓缩 5）平衡常数的测定 6）细胞及颗粒的分离6. 分子量的测定 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分 子量有关: LogM=k1-k2Ve （Ve为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对

10、数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。LogM A BCLogM测V测（三）离子交换层析 根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的 亲和力不同而达到分离的目的。 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质 ，分子中含有可解离的基团。 含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂 ，可解离出H+； 含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂 ，可解离出OH-。1.离子交换层析的原理生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质 有不同的分子大小及电荷排列方式。当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可 通过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上 ；当在一定pH下净电荷为正的蛋白质分子可 通

11、过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上 ；大分子依其与离子交换剂亲和力的不同， 而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改 变离子强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂 上先后被洗脱下来。2. 离子交换层析的应用1)水处理离子交换层析是一种简单而有效的杂质及 各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于 高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面 。 2)分离纯化小分子物质离子交换层析广泛应用于无机离子、有机 酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的 分离纯化。例如对氨基酸的分析使用强酸性阳 离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH值为 23上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐 步提高洗脱液的离子强度和

12、pH值，这样各种氨 基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分 离鉴定。全自动氨基酸分析仪就是采用这种原 理制成。3)分离纯化生物大分子物质离子交换层析是依据物质的带电性质的 不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质 等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品的复杂性，一般很难只经 过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要 与其它分离方法结合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用 其按带电性质来分离的特性，只要选择合适 的条件，通过离子交换层析可以得到较满意 的分离效果。阴 离 子 交 换 葡 聚 糖 凝 胶类 型名 称功 能 基 团阳 离 子 交 换 树 脂强酸 型Dowex 50 国产强酸17（

13、732） IR-120Zerolit 225硫酸基 SO3-弱酸 型IRC-150Zerolit 226 国产弱酸101128（ 724）羟 基 COO-阴 离 子 交 换 树 脂强碱 型Dowex 1 Dowex 2 2017（713 ）及 国产 2014（714 ） Zerolit FF IRA-400季胺基 N+R3弱碱 型IR-45 Dowex 3 国产弱碱301（701） Zerolith伯胺基N+H3 伯胺基N+H2R 伯胺基N+HR2阳 离 子 交 换 纤 维 素强酸 型磷酸纤维素（P） 磺甲基纤维素（SM） 磺乙基纤维素（SE）磷酸基OPO3- 磺甲基OCH2SO3- 磺乙基O

14、CH2CH2SO3-弱酸 型羧甲基纤维素(CM)羧甲基OCH2COO-阴 离 子 交 换 纤 维 素强碱 型三乙基氨基乙基纤维 素 （TEAE）三乙基氨基乙基 OCH2CH2N+ (CH2CH3)3弱碱 型二乙基氨基乙基纤维 素 （DEAE） 氨基乙基纤维素（AE ） 三羟乙基氨基纤维素 （ECTEOLA）二乙基氨基乙基 OCH2CH2N+H (CH2CH3)2 氨基乙基OCH2CH2 N+H3 三羟乙基氨基N+ (CH2CH2OH)3阳 离 子 交 换 葡 聚 糖 凝 胶强酸 型SE葡聚糖凝胶G25 SE葡聚糖凝胶G50 SP葡聚糖凝胶G25 SP葡聚糖凝胶G50磺乙基OCH2CH2SO3-

15、磺丙基CH2SO3-弱酸 型CM葡聚糖凝胶G25 CM葡聚糖凝胶G50羧甲基OCH2COO-强碱 型QAE葡聚糖凝胶A25QAE葡聚糖凝胶A50二乙基(-羟丙基)氨基乙 基CH2 CH3 OCH2CH2N+ CH2OH- CH3CH2 CH3弱碱 型DEAE葡聚糖凝胶A25 DEAE葡聚糖凝胶A50二乙基氨基乙基 OCH2CH2N+H (CH2CH3)2阴 离 子 交 换 葡 聚 糖 凝 胶类 型名 称功 能 基 团阳 离 子 交 换 树 脂强酸 型Dowex 50 国产强酸17（732） IR-120Zerolit 225硫酸基 SO3-弱酸 型IRC-150Zerolit 226 国产弱酸

16、101128（ 724）羟 基 COO-阴 离 子 交 换 树 脂强碱 型Dowex 1 Dowex 2 2017（713 ）及 国产 2014（714 ） Zerolit FF IRA-400季胺基 N+R3弱碱 型IR-45 Dowex 3 国产弱碱301（701） Zerolith伯胺基N+H3 伯胺基N+H2R 伯胺基N+HR2阳 离 子 交 换 纤 维 素强酸 型磷酸纤维素（P） 磺甲基纤维素（SM） 磺乙基纤维素（SE）磷酸基OPO3- 磺甲基OCH2SO3- 磺乙基OCH2CH2SO3-弱酸 型羧甲基纤维素(CM)羧甲基OCH2COO-阴 离 子 交 换 纤 维 素强碱 型三乙基氨基乙基纤维