《《细胞工程》第4章(2)：动物细胞培养工程52》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《细胞工程》第4章(2)：动物细胞培养工程52（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细 胞 工 程Cell EngineeringChapter 4、动物细胞培养 工程 41 概述 42 生产用动物细胞系 43 培养液和培养环境 44 动物细胞培养工艺 45 动物细胞培养过程的放大与优化 46 动物细胞代谢工程 47 动物细胞工程产品制备及质控 48 动物细胞工程表达产品的应用435 培养环境与生物反 应器 A、原因 动物细胞生长、代谢和产物生成受培养环 境的控制，而生物反应器提供的培养环境 能否满足需要，直接与反应器的型式、操 作状态有关； 为了给细胞生长提供足够的溶氧水平和均 一的培养环境，必须使反应器的保持一定 的混合水平和通气条件； 动物细胞较大、无壁，它对流体作用
2、力敏感（剪切敏感性），易损，所以 ，反应器的设计、放大和操作过程必 须解决供氧混合与细胞损伤间的矛盾 ； 必须了解生物反应器的传质与混合特 性、培养环境液体力学现象对动物细 胞生长、代谢及细胞操作的影响； B、具体关 系： 动物细胞对培养环境传质和混合的要求对于大规模动物细胞培养过程，其生物反应器提供的细胞培养环境必须满足细胞生长、代谢和产物生成对传质和混合的要求，主要 因素是细胞生长对氧的要求；反应器的传质能力必须满足：KLA（C*O2-CO2min）qO2C，其中，KL液体一侧氧传质系数，A气液比表面积，qO2单位细胞耗速率，C细胞密度，C*O2液体中氧的饱和浓度，CO2min液体中最低氧
3、浓度。一般而言，提高反应器的能量输入，如增加搅拌转速和通气量 减少气泡直径等，有利于提高传质速率，但增加细 矛盾胞操作速率 生物反应器设计和操作参数对传质系数有影响：传质系数（KL）受氧在培养液中的扩散速度影响，气泡大小可改变传质系数与扩散系数相互关系， 鼓泡式 小气泡（2.5mm）传质系数与扩散系数的1/2次方成正比。 传质比表面积（A）与通气量成正比，而与气泡直径的三次方成反比，如增加气量、减少气泡直径，会提高细胞死亡率实际要优化细胞破损与供氧混合过程，在最大限度满足细胞对 传质要求的前提下，减少细胞破损。 传质系数（KL）氧传质系数仍与扩散系数的2/3次方成正比，但流体主体 通气搅拌 的
4、湍（tuan）流强度对传质系数也有贡献 生物反应器气液传质比表面积（A）气泡直径和传 质比表面积主要与搅拌功率和通气量有关强化传质和抑制细胞损伤，达到合适度（优化） 决定动物细胞剪切敏感性的因素：不同细胞剪切敏感性不一，人细胞最敏感，细胞表面形 态与功能特性（细胞膜流动性）直接决定细胞剪切敏感性，流动性越强，剪切越敏感，如杂交瘤细胞； 细胞骨架结构影响细胞耐剪切能力；细胞所处生长期（生理状态）对细胞耐受剪切力有影响。 微载体细胞培养系统中的细胞损伤微载体湍流涡旋相互作用是主要因素； 悬浮细胞在生物反应器中的细胞损伤鼓泡式、气升式相对温和，决定于气泡聚并与破裂速率； 防止细胞机械破裂的培养液成分
5、 44 动物细胞培养 工艺 动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的 生产工艺； 动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点，其培养工艺过程也不同；动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、 生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑， 以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环 境和各种参数控制指标等；目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工 艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。 441 动物细胞培养工艺 基础 实验室规模（laboratory scale） A 、工艺实验研修阶段 中试规模（pilot scale） 生产规模（productio
6、n scale） 实验室设施 B、实验室管理 选址、装修、净化、布局 无菌室管理（国家相关法规） D、无菌操作技术 培养前准备、培养室和超净台的消毒、洗手与着装无菌培养操作、生物反应器的安装与消毒 442 动物细胞培养方法 原代细胞 依细胞来源，可分 传代细胞培养 液体培养 依培养液种类不同，可分 固定培养 静止培养、旋转培养、搅拌培养 依反应器类型和操 中空纤维培养 作方式不同，可分 固定床或流化床培养 悬浮培养 依在反应器生长 贴壁培养 形式不同，可分 贴壁-悬浮培养（假悬浮培养） A、悬浮培养 （suspension culture）： 是指细胞自由地悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法
7、；适用于悬浮培养的 生产细胞有杂交瘤与骨髓瘤细胞（SP2/0， NSO），不适用于正常细胞培养。此种方法操作简便，传质和传质比较好，易放大， 条件均一；但需产物截流。1996-2000年， 美国，FDA批准70%重组治疗药物。用重组技术或细胞融合技术建立的工程细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度 培养时，都需经过一定时间的细胞适应能 力驯化； 细胞对无血清培养条件的适应能力和生长形式的驯化，对于建立优化的无血清高 密度培养工艺非常重要； 通过驯化期可以逐渐修复那些不适应的细胞群体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能 特性（如细胞生长率、产出率、细胞死亡率、基 因稳定性等）的细胞克隆或细胞群
8、；悬浮培养 无血清培养条件的驯化的驯化 高细胞密度培养的驯化主要包括 （时间、难度不一）贴壁生长转化为悬浮生长的驯化B、贴壁培养 （anchorage-dependent culture） 是指让细胞贴附在某种基质上进行增殖的培养方法。主要适用于贴壁细胞或兼性贴壁细胞，如 CHO、BHK、Vero等，用灌流培养模式可维持较长的培养周期，关键是提高细胞密度，进行放大培 养；适于贴壁依赖性和非依赖性细胞。 优点：易于灌注和优化控制，细胞生长密度高， 产率高，产物易收取和纯化，培养液利用率高； 433 动物细胞培养的操作方式 444 培养过程的监测与 控制445 动物细胞培养工 艺446 工艺的选择
9、与设计 （反应器投入占整个部分50%）B、生产工艺的设计原则447 杂交瘤细胞大规模培养 制备 抗体的工艺 A、工艺流程图 肝癌单抗片段Hab18F（ab/）2体外制备工艺B、主要设备1L悬浮搅拌培养瓶Superspinner（德，BraunBiotech）杂交瘤细胞悬浮培养种子细胞（磁力搅拌无气泡供气，10um细胞连续旋转过滤器，其它全控）5L细胞发酵罐（德国，BraunBiotech）杂交瘤细胞连续悬浮培养30L细胞发酵罐BiostatRC20（德国，BraunBiotech） （冷热循环蒸汽控温，四气混合控制供气） 杂交瘤细胞连续悬浮培养的放大 生物反应器生物反应器的操作生物反应器的监控系统生物反应器连接和排流管道低温调整离心机系统控制面板国产生物反应器及操作C、无血清流加培 养工艺【习题】1、概述肝癌单抗片段Hab18F(ab)2无血清流加培养工艺技术流程？
