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1、 分子生物学实验技术专题电泳技术简介什么是电泳技术？电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、 核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维 素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于 电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的 速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用 适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其 百分含量的方法。电泳技术的分类电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电 泳（有支持体）两大类。 自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、 等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层 电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝 胶性支持体区带电泳（支
2、持体有：淀粉，纤维素 粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼 脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：实验原理 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依 氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖 束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此 该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、 鉴定及纯化。琼脂糖凝胶电泳：实验原理 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应 与分子筛效应。不同DNA的分子量
3、大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同 的区带。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值 成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分 子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同 ，但构型不同的DNA 分子。琼脂糖与琼脂的区别 琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶（ agaropectin）组成的。琼脂糖的结构单元是 D-半 乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多更 小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似， 但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除， 否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取 代电离基团，就会造成
4、电内渗，电内渗对质点的 移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比 较低，通常在0.2%以下，电内渗比较小，通常在 0.13%以下。 简言之，琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身 独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。琼脂糖凝胶电泳特点琼脂糖凝胶的配置 1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1 TAE或0.5TBE。 注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。 2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。 3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖 注意：必须保证琼脂糖充分完全
5、溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。琼脂糖凝胶的配置3. 使溶液冷却至60左右，如需要可在此时加入 溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充 分混匀不提倡使用。 注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的 溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。 5. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置 处插上梳子。凝胶厚度一般在35 mm 之间。注意：不要产生气泡，溶液温度太高(60)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。 6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳
6、。 注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存25 天 。琼脂糖凝胶缓冲液有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E缓冲液）Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要 更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低 ，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条 带模糊或不规则DNA带迁移。电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电 流加大，凝胶发热。琼脂糖凝胶载样缓冲液载样缓冲液是
7、上样时与样品一起加入泳道的。 载样缓冲液有三个作用： 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内； 使样品带有颜色便于上样操作； 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳 极迁移。 上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二 甲苯氰FF。琼脂糖凝胶载样缓冲液溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰 FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无 关； 在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约 与长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲苯 氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%浓 度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。琼脂糖凝胶载样缓冲液影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DN
8、A的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为 碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时 大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子， 所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋线 性DNA）一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小 、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7简言之，浓
9、度越大，分子孔径就越小，DNA迁 移速率就越低，反之迁移速率就大。 另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大 ，分辨率越高，但分离的片段就越小。琼脂糖凝胶的浓度影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环 。影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电 压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超 过5-8V/cm影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度
10、2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制 的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。琼脂糖凝胶的浓度影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量 就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质 等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向; 溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA 不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电 导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔 化，也会使DNA变性。影响电泳迁移率的因素
11、 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7染色剂溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减 少、刚性和长度增加，因此，线性DNA-染料复合 物在凝胶中的迁移率约降低15%。DNA电泳常见问题分析问题原因解决办法DNA带模糊 1) DNA降解避免核酸酶污染2) 电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱 ，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液3) 所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度 应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4) DNA上样量过多减少凝胶中D
12、NA上样量5) DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6) 有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白7) DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNADNA电泳常见问题分析问题原因解决办法不规则DNA带迁移 1) 对于/Hind III片段cos位点复性电泳前于65加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟2) 电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm；温度30 ；经常更换电泳缓冲液3) DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳 前勿加热带弱或无DNA带 1) DNA的上样量不够增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶 电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样 量可适当降低2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶 浓度4) 对于EB染色的DNA，所用光源 不合适应用短波长（254nm）的紫外光源DNA电泳常见问题分析问题原因解决办法DNA带缺失1) 小DNA带走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强 凝胶浓度2) 分子大小相近的DNA带不 易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶 浓度3) DNA 变性电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 不合适在脉冲凝胶电泳上分析
