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1、人体外周血淋巴细胞培养 与染色体组型分析一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。 2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体 标本制备。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析 方法。二、实验原理1、人体的1ml外周血中约含有1106 3106 个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0期或G1期 ，一般情况下不分裂。 采用人工离体培养的方法，在培养基中加入 植物血球凝集素（PHA）能刺激淋巴细胞转化 为淋巴母细胞而进行有丝分裂。2、经过短期的培养，秋水仙素处理、低渗和 固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。 最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好 的染色体标本。 3、核型（karyotype）是指一个细
2、胞内的整套 染色体按照一定顺序排列起来所构成的图 像。正常细胞的核型能代表个体的核型。 4、组型是以模式图的方式呈现，它是通过许 多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的， 是理想的、模式化的染色体组成，代表一物 种染色体组型的特征。人类染色体组型群组号染色体号形态大小着丝粒位置随体次缢痕鉴别程度A13最大M无常见1号可鉴定B45次大Sm无 不易C612+X中等Sm无常见9号难鉴定D1315中等St有偶见13号难鉴定E1618较小16m,17m和18m无常见16号可鉴定F1920小M无 不易G2122+Y最小St有、Y无 难鉴定核型分析的参照图男性染色体核型 女性染色体核型三、实验材料与试剂 实验
3、材料：人体外周血淋巴细胞 实验试剂： 1.培养基：完全RPMI1640培养基,含双抗和小牛血清 2.秋水仙素：0.4mg/ml 3.低渗溶液：0.075mol/L KCl 4.磷酸缓冲液 pH6.8 5.固定液：Carnoy固定液 6.PHA:0.15mg/ml 7.Giemsa染液：磷酸缓冲液(pH6.8)与Giemsa原液(9:1)(现配 )四、实验方法与步骤 1、培养液配制 2、采血与培养 3、秋水仙素处理 4、标本的制备 5、染色培养液配制 在超静工作台内无菌操作 每个培养瓶中加入3ml培养液后，再加入 PHA ，PHA的终浓度为0.15mgml，将上述 试剂加入培养瓶中后，反复吹打使
4、其混合 均匀。每组共配制4瓶。采血与培养 11月12日11：00到医院采血常规消毒后， 将灭菌小瓶送入超净工作台 ，在火焰旁将 血液滴入4个盛有3ml培养液的培养瓶内（ 男女各两个），每瓶0.18ml，盖上橡皮塞， 轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放 在37恒温箱内静置培养72h。（每天摇动 培养瓶两次）采血与培养 培养的外周血细胞经恒温培养，于培养前3 小时（即11月15日8：00）的外周血淋巴细 胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度成 为0.4mg/ml。继续培养3个小时培养瓶瓶标号完全培养基（ml）血量（ml）秋水仙素终浓度（ug/ml）秋水仙素作用时间 （h）10mg/mlPHA（微升
5、）1（男生）30.1816uml3602（男生）30.18半滴3603（女生）30.188uml3604（女生）30.18半滴360标本的制备 1、终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管 内，离心沉淀8分钟(1000r/min)，弃去上清 液。 2、先加入1ml加入低渗液，轻轻吹打，使细胞 重悬，然后在加入37预温的低渗液6m1，轻 轻打匀，置37水浴箱中20分钟。（使白细胞 膨胀，染色体分散、红细胞解体。） 3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心8分钟 (1000r/min)。 4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定 液6m1，轻轻吹打混匀，置室温20分钟。离
6、 心沉淀1000 r/min，8分钟。 5、重复第4步。 6、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多 少加入适量固定液(0.30.6m1)，轻轻吹打 成细胞悬液。 7、滴片：取保存在冰水中的冰冻载 玻片，稍倾斜，用滴管吸 取细胞悬液，从0.6m高处 滴2滴于玻片上，立即用口 对准玻片吹气，使细胞在 玻片上散开，然后在烘箱 略烘一下。每个培养瓶中 的细胞滴2-3张（即每人至 少两张片子），共计一共 10张片子。染色 1、把滴好的在载玻片放入染缸中，将稀释 后的Giemsa染色滴在染缸里中，室温染色 20分钟； 2、自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面） 35秒钟，晾干（或烘干）； 3、镜下观察染色体分带
7、及染色情况。五、注意事项 1 、细胞培养的环境必须无污染环境，温度保持 恒定，有适宜气体环境，pH适宜。 2、 操作及培养条件、培养仪器等无菌避免污 染。 3、控制好离心速度，过快或过慢都会影响实验 结果。 4、低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细 胞体积膨大，染色体松散，处理时间过长染色 体丢失会影响观察，处理时间不足，细胞内染 色体会聚集在仪器无法区分。六、核型分析结果 女性染色体男性染色体结果分析讨论一、在这次试验中我们做了4张片子，但其中一男一 女两张装片没有看到分裂相，分析原因可能有以下 几点： 1、片的高度不够，导致细胞没有摔开。 2、秋水仙素用量分配不均，导致用量不足。 二、核
8、型结果分析： 核型分析数据与正常的核型数据比较吻 合。 女生组的细胞较好，经过三天的恒温培养 细胞的数目较多，分裂相也较多，但是男 生组的细胞数目就很少，分裂相也很少。 原因可能以下几点有: 1、男生的细胞不容易被PHA诱导分裂； 2、男生的细胞在制作装片的时候有损失； 3、秋水仙处理时的用量太少（只有半滴 ）。 三、染色体制备不佳，原因如下： 1、无菌操作不够严谨。 2、男生的淋巴细胞不容易被PHA诱 导。 3、染色体标本质量不佳。 四、染色体质量做的不佳，原因可能为： 1、秋水仙素处理不当：秋水仙素溶液的浓度 与处理时间有一定的关系，时间太短，则标本 中的分裂细胞就少；时间太长，染色体缩得太 短，不易观察。 2、低渗处理不当：时间过长，细胞膜往往过 早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；时间不 足，细胞膨胀不够，染色体分散不佳，难以进 行染色体计数分析。 3、标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲 醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模 糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。 4、 载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴 在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且谢谢！
