原位pcr技术

《原位pcr技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《原位pcr技术（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、原位PCR技术沈轻珊 08中鉴（1） 0806503123原位PCR是将PCR技术与原位杂交技术结合，从而在组 织原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列。1985 年建立起来,成为首推迄 今 为止 对 分子 生 物 学 形 响最 大 的技术。原位PCR技术.扬PCR技术敏感性高可以很容易地检测 到低拷贝量的病毒DNA以及几乎任何一种特定的核酸序 列甚至于检出仅有一个拷贝的基因序列，避其必须先从 样品中提出DNA, 结 果 与 形 态 特 征 脱 节 不 能进 行 细 胞 定性 及 细胞 内定 位之短。 扬 DNA分 子杂交技术则是 可 以 进 行 与组 织 学 特 征 相 关 的 核

2、酸 研 究，包括 DNA的 细 胞 内 定 位 ，避敏感度有限 常需 至 少20个拷 贝 量 的核 酸 序 列 基本原理 由于细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进PCR扩 增时，各种成分（如如引物、DNA聚合酶、核苷酸 等）均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或 细胞核内的RNA或DNA为模板，与原位进行扩增。 扩增的产物一般分子较大、或互相交织，不易穿过细 胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有 的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在 原位以呈指数级扩增，扩增的产物就可以被原位杂交 技术检测出来。 基本步骤 1、细胞固定： 细胞固定旨在保存细胞形 态结构. 并非所有的固

3、定剂都能成功的用干原 位PCR.已 经 有 应 用酒 精闭 酒 精 醋 酸 混 合液，以及14%多聚甲醛固定而 原位 扩增。 但以实验的经验及报道更多人推崇10%中性 福 尔 马 林。经固定 的细 胞 ，其原 位 PCR 产物常游离 于反 应物中, 反 映 了 这 些 固 定 剂 未 能 很 好 地 将 蛋 白 以及核 酸变性、交 联 。相才 反 福 尔马 林 则 能 很 好 地 使蛋 白质 凝 聚 核 酸 交 联， 从 而 形 成 有 效 的 限 制PCR产 物 扩 散 的 网 络性 屏 障。固定 时间以 不超15小时为宜。基本步骤 2、蛋 白酶 消 化： 用 醛 类 固定 剂 可 以 使

4、核 酸 与蛋 白质 交 联 形 从 网 络性 的 屏 障结 构 这 种 屏障虽 然 对 防 止 扩 增 产 物 扩 散 有 益 却 妨 碎 了PCR反 应中 的 主 要 试 剂 充 分 透 入， 与靶 DNA接 触。 因而 使 用 醛 类 固 定剂 以 后，适当 的蛋白酶有利于建立试 剂接触靶DNA的通道 以 及 充 分 暴露 靶DNA。由于蛋白酶消化同时可 以 破 坏 业 己形 成 的 核 酸 蛋 白质 阿络 结 构， 因而 过 量 的 消化 将使扩 增产物 容 易扩散 。常用 的蛋 白 酶 有: 胃蛋 白酶, 工 作 浓 度2mg/ml;蛋白酶K，工作 浓度0.25 mg/ml。对于福尔马

5、林固定 的细 胞 或 石 蜡 切片， 消 化 时 间 以 室 温 下10到15分 钟 为宜 .。 短 暂固 定 的 细 胞 或 经 酒精、丙 酮固定 的 细 胞 ，不 用 蛋白酶 消化 也 有 成功 扩 增 的。 基本步骤 3、 原位 PCR扩增: 成 功 的原 位 扩 增 需要 下列条件: 扩 增 效 率 要 足 够; 不 能 有 引物 错 配 或 引物错配或引物寡聚；PCR产 物 尽 可 能 多 的原 位 滞 留 （1）提高 扩 增 效 率：原位PCR过程中常以增 加 关 键 试剂 或 扩 增 液成 分 的 浓度 来提 高效率。 （2）降低引物错配和寡聚：目前使用的方法是在温度到足够高 从

6、而足以阻止引物的非特异性 结合 之 后 加入Taq酶。新近 报道 的 SSBs法 也 是 一 种很 有 参 考 价值 的降低引物 寡聚 和 错配 的方 法 。 （3）引物 的选 择 就 扩 增 片 段 而 言。 所 采 用的 引物 其 产 物 的 长 度 不 可太 短 也 不 可 过 长，太 短 产 物 容 易扩散 月 过 长 则 护增 效率 受 影 响。就 引物 的 数 量而 言 可 用 瑞 对或 多 对 引 物 。 （4） 循 环周 期： 原位PCR的扩增 效 率 不 及液相PCR, 因而 掀 环周期不宜太 少 ,否则 产物少, 信号 不 够。但 周 期 太 多， 产 物 易扩 散。 通常

7、采用的循环周期为20到30个。可以采取2到3个循环 步骤。 基本步骤 4、产 物检 测： 直接和 间接 的 原位法 有着完全不 同的检查法。前者 采 用 放射 自显 影 免 疫组 化 或 荧光镜 检等 而 后 者 则需要 特异性 标 记 的探 针 进行原位 杂交。基本分类 根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大 类。此外，还有反转录原位PCR技术等。 1，直接法原位PCR技术 直接 法 是 在进 行 原 位PCR扩增 之前， 把 同位 素 （不常 用） 或非 同位素（ 常 用） 标记的 核苷 如Dig-l1-dUTP及Biotin-l1-dU

8、TP等或荧光素 标 记 的 引物 加 入PCR反 应 液 中, 随着扩增 的进 行 标记 的核普 直接掺 入 到PCR产物中， 然后用 放 射 自显 影， 免 疫 组 织 化 学 或 荧 光 检测 术进行DNA序 列 的检 出及 定 位。该 法步 骤 较少 ， 但需注意假阳性的出现。基本分类 2、 间接法原位PCR技术 间接 法 是 先 进 行 细 胞 内 DNA 分子原位 扩增 ，然 后 结 合核 酸 分 子 原 位 杂 交 进 行DNA序列 检 出及 定位 的技 术 该 法 步 骤 相对 较 多 需 时长， 但结果可 靠。 3、原位反转录PCR技术 原位反转录PCR是将原位反转录PCR技术

9、应用到组织细胞 标本中的一种新技术，与RT-PCR不同点在于：进行原位 反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破 坏组织的DNA酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反 转录合成cDNA，而不是细胞原有的DNA。其他步骤与液 相原位反转录PCR相似。应用原位 PCR 技术是一种将 PCR 技术的高度敏感、 高效扩增的特点与分子杂交方法精细定位的特点紧 密结合在一起发展起来的分子分析技术。它在原位 检测低拷贝基因及基因低水平的表达方面有着其独 特的优越性。这一技术从建立以来就受到国外有关 研究领域许多学者的重视 ,近年来 ,国内亦有了少数 报道10 ,11 。目前原位 PCR 主要

10、应用在三个领域 :外源基因检测 ,基因变异的鉴定和基因表达研究。 4.1 外源基因检测 4.1.1 感染基因检测应用 4.1.1 感染基因检测许多疾病是由于细菌、真菌、病毒等感染而引起的 。应用原位 PCR 对艾滋病毒 ( human immunodefi2ciency virus type 1 ,HIV) 进行研究 ,导致了许多重大发Zehbe 等应用原位自我再生式 序列复制反应( 3SR) 技术对宫颈癌 Si Ha 细胞系中 单拷贝人类乳头瘤病毒 ( Human papilloma virus , HPV ) 的游离基因进行了检测 。运用原位 PCR 和 原位 R T2PCR 还研究了许多

11、保存的组织样品和细 胞系中的其它病毒感染和细菌感染 。包括乙肝病毒 ,丙肝病毒 ,单纯疱疹病毒 ,麻疹病毒 ,脊髓前角灰质 炎病毒和结核杆菌等 。应用4.1.2 人工转入基因的检测随着分子生物学和基因工程的迅速发展 ,越来越多 的人从事转基因研究 ,在动物，植物转基因方已有 不少成功的例子 ,在转基因动物成功的基础上发展 起来的人的基因治疗正显示着美好的发展前景 。 4.2基因变异的研究生物体具有遗传和变异的特性 ,当机体内外环境改 变时 ,有的基因会发生改变 ,随之也可能发生相应的 功能改变 。原位 PCR 能用于基因突变 、基因重组 和染色体易位等基因变异研究 。应用4.3 基因表达及定位

12、研究原位 RT2PCR 技术能够反转录 mRNA 到 cDNA ,然后原位扩增 cDNA 来检测 mRNA 的表达。它可用于检测固有内源性 基因表达和导入的外源基因表达两方面。 其定位水平从组织细胞水平逐渐发展到了 亚细胞水平和染色体上。总结 原位 PCR 正经历着一个不断发展和完善的过 程 ,在动物及人类研究中发展较快 ,成为一种 有力的基因诊断学技术。在植物研究方面 ,由 于植物细胞壁对核苷酸起阻碍作用 ,运用该技 术具有更大的难度。但最近在植物方面也取得 了一定进展。相信 ,随着技术、方法上的日渐 成熟 ,原位 PCR 技术将在分子生物学、分子发 育生物学、分子遗传学、分子病理学、分子病 毒学以及临床医学等各学科领域里将有着广泛 的应用前景并将发挥愈来愈重要的作用。THE END 谢谢！