感染性疾病的基因诊断

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1、感染性疾病的基因诊断 重点介绍两个内容n分子诊断学n感染性疾病的基因诊断第一节 分子诊断学现代生物学和现代医学研究都已经证明，除外 伤和非正常死亡以外，人类所有疾病的发生 、发展和转归都与遗传物质(DNA)的直接或间 接变化相关，这标志着现代医学的发展已逐 步进入“基因组医学”时代。 而基因组医学对疾病诊治的首要贡献便是“预 测医学”(predictive medicine)。所谓预测医 学就是在受精卵及其卵裂期、胚胎期、胎儿 期、婴幼儿期或个体发病前期对遗传物质 (DNA)的直接或间接变化进行分析，以识别出 疾病相关基因的结构异常或功能异常或识别 出发病风险基因的携带者，从而进行有效的 预防

2、和治疗。 很显然预测医学是以分子诊断(molecular diagnosis)技术为基础的。人类常见的遗传性 疾病有150200种，较为罕见的疾病有600 800种，它们可能与人类3000040000个基因 中的几千个基因相关。 人类基因组DNA全序列数据的公布以及几十种细 菌、啤酒酵母、秀丽线虫、黑腹果蝇、拟南 芥等多种模式生物全基因组序列测定的完成 ，都为人类遗传病和感染性疾病的分子诊断 奠定了基础。一、分子诊断学的发展现代预测医学分子诊断的诞生可追溯到1978 年，著名美籍华裔科学家简悦威(YuetWai Kan)首先应用液相DNA分子杂交技术对镰刀 形细胞贫血(S)实现了产前基因诊断。

3、 诊断的基本原理某一疾病的基因与某一遗传性标志连锁在一起 ，当时的遗传性标志就是限制性片段长度多 态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLPs)，即不同个体的 DNA用同一限制酶切割产生片段的大小可不 同，而这种不同与某种疾病或疾病的基因连 锁在一起，从而间接地诊断疾病。 这之后，基因诊断技术虽然只有短短的20多 年历史，但对疾病诊断学的影响作用却是革 命性的。遗传标志从第l代的RFLP，到第2代 遗传标志(短串联重复序列)，到第3代遗传标 志(单核苷酸多态性：SNP)，到直接检测基因 ；分析的层次从DNA到RNA到蛋白质； 分析的方法

4、DNA液相杂交和固相点杂交； 基因限制酶酶谱分析； 限制性片段长度多态性连锁分析； RNA杂交； PCR体外扩增；荧光原位杂交(fluorescence insitu hybridization，FISH)； DNA测序； 生物芯片(DNA chip)技术； 蛋白质印迹； 免疫细胞化学 使传统的基因诊断(DNA诊断)概念发展到更全面 的分子诊断(DNA诊断、RNA诊断和蛋白质诊断 )的新概念。1999年3月，美国医学委员会(ABMS)批准美国 医学遗传学委员会(ABMG)和美国病理学委员 会(ABP)创立一项旨在推动美国分子诊断的认 证资格培训计划：分子遗传病理学(MGP)，要 求MGP的地位

5、必须等同于医学及人类遗传学和 病理学。申请MGP培训的医师必须拥有MD或DO 博士学位，并已经获得医学专业委员会颁发 的行医资格认证，等等。1999年11月，美国 病理学会创办的Joumal of Molecular Diagnostics杂志正式出版，标志着分子诊 断的发展掀开了新的一页。二、分子诊断的常用技术分子诊断的基础是分析被筛查者的组织细胞、 毛发、抗凝血或干血迹，甚至甲醛(福尔马林 )固定、石蜡包埋的组织中的基因。目前用于分子诊断的技术主要包括PCR-STR、 原位PCR、FISH、RT-PCR、PCR-RFLP、PCR- SSCP、多重PCR、定量PCR、DNA测序、DCGE、

6、异源双链分析、化学裂解和酶裂解错配分析 、蛋白截断测验、质谱法(mass spectrometry)以及DNA芯片等。1Southern印迹技术 Southern印迹是分析DNA结构的一种技术，由 于人体内除了红细胞外几乎所有的细胞均可 分离到足量的供Southern分析的DNA，所以用 Southern印迹技术可对缺失、重复及点突变 引起的疾病诊断。DNA分子经经限制性核酸内切酶酶切，经琼经琼 脂糖凝胶电电泳将所得 DNA片段按分子量大小分离，然后将含DNA片段的琼琼脂糖凝胶变变 性，并将其中的单链单链 DNA片段转转移到硝酸纤维纤维 素膜或其它固相支 持物上，而各DNA片段的相对对位置保持

7、不变变。这这种滤滤膜即可用于 下一步的杂杂交反应应。2Western印迹技术 Western印迹技术是检测特定的蛋白质的方法。X 连锁隐性遗传的Duchenne肌营养不良(DMD)是 由于基因缺陷而使肌细胞增强蛋白 (dystrophin)合成异常，用Western法可检测 患者肌细胞增强蛋白，从而对DMD及症状较 DMD轻的进行分子诊断3PCR技术 PCR技术及在此基础上发展起来的RT-PCR、PCR- RFLP、PCR-SSCP、多重PVR、定量PCR等技术 已成为目前进行分子诊断必不可少的技术。 珠蛋白生成障碍性贫血的各种类型中以 Bart胎儿水肿综合征最为严重，本病患者两 条16号染色

8、体上的4个。基因均有异常。用两 段核苷酸PCO1，和PC02作为 基因的扩增引物 ；PCO3和PC04作为11号染色体上的 基因的 扩增引物并以此为内参照。从羊水细胞中提 取DNA，以PCR法扩增，经2030个周期后， 将扩增样品电泳、染色后即可作诊断。4FISH技术 FISH技术即荧光原位杂交速、简便、灵敏等优 点。尤其是与传统的染色体技术比较更易检 出易位、倒位、微小缺失等异常。FISH技术 还可以作为肿瘤的辅助诊断方法。5生物芯片 生物芯片的发展将是分子诊断的一次重要革命。 DNA芯片又称DNA微列阵，它利用徼点阵技术 ，将探针(通常是DNA或cDNA)以高密度点阵的 形式按一定的顺序固

9、定排列在1 cm2的硅片( 玻片、尼龙膜等)表面上，再将所研究的样本 材料如DNA、RNA或cDNA用荧光标记，在芯片 上与探针杂交；然后通应用于染色体病诊断 和产前诊断，具有过激光共聚焦显微镜等对 芯片进行扫描，井配合计算机系统进行分析 ，从而快速、准确地得出所需信息。DNA芯片将生命科学研究中的许多不连续的分析 过程，如样品制备、化学反应和分离检测等 ，移植到芯片中并使其连续化和微型化。为 快速检测病原体和疾病组织中的突变序列提 供了手段，并可实现高通量、大规模的操作 。目前已研制出用于检测HIV基因、囊性纤维性 变相关基因、P53基因、乳腺癌相关基因等20 多种基因芯片。例如已有人用有9

10、6000个核苷 酸探针的芯片，成功检调出乳腺癌和卵巢癌 基因BRCA-1第11外显子上的24个杂合突变。 三、分子诊断技术的应用 目前已经能够进行分子诊断的疾病包括如下几种 。 1染色体疾病的诊断和产前筛查 染色体疾病包括染色体数目异常和结构畸变。 目前已发现的人类染色体疾病约10000多种， 已确定或已描述过的综合征约100多种。例如 最常见的染色体疾病Down综合征(在新生儿中 的发病率约为1/6001/800)、神经管缺陷症 以及性腺发育不全等多种染色体异常造成的 先天性缺陷。染色体疾病可在光学显微镜下观察和识别，而 特异的FISH诊断技术已成型、成熟。不仅可 以进行染色体诊断，还可以进

11、行产前筛查， 指导优生优育。2单基因疾病的分子诊断和产前诊断 单基因疾病由单个基因发生突变引起的遗传性 疾病。已发现的人类单基因病多达400种以上 。迄今，已经了解许多单基因疾病的致病基 因以及发病机制，例如苯丙酮尿症、G6PD缺 乏症、肝豆状核变性(Wilson 病)、 Huntington 舞蹈症、脆性X综合征、Marfan 综合征、血友病A、血友病B、血红蛋白病、 珠蛋白生成障碍性贫血、软骨发育不全、先 天性肾上腺皮质增生症、糖原累积症、多囊 肾、家族性高胆固醇血症、家族性单纯生长 激素缺乏症、某些神经肌肉系统疾病(如进行 性肌营养不良)、线粒体疾病(如Leber视神经 萎缩)等。对于单

12、基因疾病，诊断越早、治疗越早，则 预后越好。例如一旦筛查确诊为苯丙酮尿症 患儿，即应喂苯丙氨酸含量低的奶粉，进行 饮食控制疗法，可防止智力受损，甚至智力 发育可达正常水平。而有些单基因疾病属于X 性染色体连锁遗传方式，具有性别遗传的特 点，或只传男或只传女，因此通过产前诊断 进行性别选择，可以达到优生优育的目的， 解除患者的切身痛苦。3多基因疾病的分子诊断 多基因疾病是大面积危害人群健康的多发病、 常见病，如恶性肿瘤、心血管类疾病(动脉粥 样硬化、高血压等)、糖尿病、神经系统疾病 (早老性痴呆、重症肌无力等)、精神-心理疾 病(精神分裂症、抑郁症等)、白血病、哮喘 、自身免疫性疾病(系统红斑狼

13、疮、类风湿关 节炎、白塞病等)、近视眼等。这些疾病的分子病因十分复杂，大多尚未找到 疾病易感基因，可采用已知基因标志(geneic marker)的连锁分析和关联分析方法，对疾病 进行亚型的基因分型和鉴定等辅助诊断，以 利于疾病的正确治疗。4感染性疾病的分于诊断 近年来，感染性疾病如伤寒和副伤寒、痢疾、 结核、流行性出血热、病毒性肝炎、细菌性 食物中毒、败血症、性病以及艾滋病(AIDS) 等的发病日益上升。感染性疾病的诊断目前 主要依靠病原学及免疫学检测，但由于抗生 素的广泛应用，细菌感染性疾病的病原学及 免疫学检测的敏感性受到一定影响，使得感 染性疾病的诊断受到限制。特别是结核杆菌、幽门螺杆

14、菌、人类免疫缺陷 病毒、丙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、汉 坦病毒感染的诊断问题尤为突出。分子诊断 技术具有快速、准确、特异性高、敏感性强 等特点，不仅可以对感染性疾病的病原体进 行定性，而且可以定量。目前可以开展分子诊断的感染性疾病病原体主 要有结核杆菌(引起结核病)、幽门螺杆菌(与 消化性溃疡、胃癌的发生密切有关)、乙型肝 炎病毒(引起乙型病毒性肝炎)、丙型肝炎病 毒(引起丙型病毒性肝炎)、庚型肝炎病毒(引 起庚型病毒性肝炎)、人乳头瘤病毒(主要引 起尖锐性湿疣等，其中某些型别可能与宫颈 癌的发生密切有关)、汉坦病毒(引起流行性出血热)、类风湿因子( 用于辅助诊断类风湿性关节炎)、c反应蛋白

15、( 为肺炎球菌的c多糖物质，在急性炎症时增加 ，主要用于辅助诊断活动性风湿热等)、淋球 菌(引起淋病，其中性病淋巴肉芽肿亚种主要 引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿)、沙 眼衣原体(引起沙眼)、梅毒螺旋体(引起梅毒 )、生殖器支原体(引起泌尿生殖系感染与不 育)、单纯疱疹病毒(其中HSV-2主要引起原发 性生殖器疱疹)、人类嗜T细胞病毒(可引起T细胞白血病)、EB病 毒(可能与儿童恶性淋巴瘤、鼻咽癌的发生有 密切关系)、巨细胞病毒(孕妇早期子宫内感 染可引起死胎、早产和先天畸形)、水痘-带 状疱疹病毒(可引起水痘、带状疱疹，孕妇患 水痘可引起胎儿畸形、流产和死胎)、卡氏肺 囊虫(主要引起AID

16、S的继发感染)、嗜肺军团 菌(引起呼吸道感染)、腺病毒(引起呼吸道、 眼结膜或胃肠感染)、伯氏疏螺旋体(引起莱 姆病)、阴道毛清虫(引起滴虫性阴道炎)、疟 原虫(引起疟疾)、HIV(引起AIDS)。对上述感染性疾病病原体基因的检测，主要采 用PCR结合ELISA的方法，以降低特异性差 及PCR污染带来的误诊问题。 5恶性肿瘤的分子诊断 目前肿瘤的治愈率仍不高，主要原因就是早期 诊断及正确选择化疗药物敏感性存在较大困 难。造成到医院确诊的癌症患者，85%属晚期 ，70%以上已有远处转移。因而，肿瘤的早期 发现和诊断对肿瘤的预防和治疗至关重要。n 肿瘤标志在诊断肿瘤、检测肿瘤复发与转移 、判断疗效和预后以及人群普查等方面都有 较大的实用价值。n肿瘤标志可分为基因标志和基因表型标志， 基因标志是指基因本身突变和表达异常，能 反映癌前启动阶段的变化；基因表型标志是 指基因产物表达和调控异常，表现为其所编 码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原、 异位蛋白，一般出现较晚。因此，寻找特异性肿