食品中防腐剂-------苯甲酸含量的测定

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1、 任务1 食品中防腐剂-苯甲酸含量的测定思考1. 如何测定食品中防腐剂苯甲酸的含量？2. 所测定产品的质量合格么？能力目标能利用液相色谱法测定食品中防腐剂苯甲酸的含量；能熟练操作及使用液相色谱仪器； 能对仪器进行保养和简单的维护；能分析所测的色谱图数据并给出结果知识目标液相色谱法的基本原理液相色谱仪基本构造及使用方法；液相色谱法的定性分析及定量分析方法 学习情境1.试验原理：将试样加温除去二氧化碳和乙醇，调pH至近中性，过滤后进入高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。 甲醇：经滤膜过滤（0.5微米） 稀氨水（1+1）：两者等体积混合 乙酸铵溶液（0.02mol/

2、L）：称取1.54g的乙酸铵，加水至1000ml.溶解，经0.45微米滤膜过滤。 碳酸氢钠溶液（20g/L）:称取 2g碳酸氢钠（优级纯），加水至100ml摇匀 注：方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为蒸馏水，溶液为水溶液。2. 试剂 苯甲酸标准储备液：准确称取0.1000g苯甲酸，钾碳酸氢钠溶液（20g/L）5ml,加热溶解，移入100ml容量瓶中，加水定容，苯甲酸含量为1mg/mL 苯甲酸标准使用溶液：取储备液10.0ml,放入100ml容量瓶加水稀释至刻度，摇匀。经0.45微米滤膜过滤。 高效液相色谱仪；紫外检测器(FID)； 色谱柱;YWG-C18 4.6250mm； 1

3、0m不锈钢柱 流动相：甲醇：乙酸铵溶液（0.02mol/L）(5:95) 流速：1ml/min 进样量：10L 检测器：紫外检测器，230nm,0.2AUFS注：根据保留时间定性，外标峰面积法定量。3.仪器及条件 汽水：称取5.00g10.0g试样，放入小烧杯，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调pH约7.加水定容至1020ml,经滤膜过滤（0.45m） 果汁类：称取5.0010.0g试样，用氨水（1+1）调pH约7.加水定容至适当体积，离心沉淀，上清液经滤膜过滤（0.45m）。 配制酒类：称取10.0g试样，放入小烧杯，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）调pH约7.加水定容至适当体积，经

4、滤膜过滤（0.45m）。 4试验程序：试样中苯甲酸含量（g/Kg）,按下式计算5. 结果的表示和计算：式中 X -试样中苯甲酸的含量（g/Kg）A-进样体积中苯甲酸的质量（g）V2 -进样体积，（ml）V1 -试样稀释总体积，（ml）m-试样质量，（g）重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%6. 精密度7实验结果分析：判断产品质量是否合格 ？相关理论知识一、高效液相色谱分析法（HPLC）概述高效液相色谱还可称为高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱或现代液相色谱，与经典液相（柱）色谱法比较，HPLC能在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。高效液相色谱分析法

5、与气相色谱分析法一样，具有选择性高、分离效率高、灵敏度高、分析速度快的特点，但它恰好能适于分析气相色谱分析法不能分析的高沸点有机化合物、高分子和热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱分析法的不足。高效液相色谱流程气相色谱与高效液相色谱的比较 二、高效液相色谱的主要类型（一）液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂1.分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 2.固定相：与LC比，固定相粒径不同（10m） 硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶 无定形 YWG 5 6m 5104球形 YQG 34m 8108 堆积硅珠 YQG 34 m 8108

6、 理想原理：吸附特点：峰易拖尾高分子多孔小球：YSG特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物3. 流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -4. 影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性，洗脱能力，k，tR溶剂系统极性，洗脱能力，k， tR注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5. 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱（二）.液液分配色谱法（LLC）1.分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异2.固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用固定液极性NLLC固定液非极性RLLC3.正相色谱固

7、定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分4. 反相色谱固定液极性 固定相极性底剂 + 有机调节剂（极性调节剂）例：水 + 甲醇，乙腈，THF 流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR 出柱顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 正相键合相色谱 分离原理：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 流动相：极性小（同LSC）底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k 出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先

8、出柱，极性大的组分后出柱 适用：分析极性大物质、糖类等（四）. 凝胶色谱法(SEC) 分离原理：凝胶色谱又称为体积排阻色谱(SEC)，是按溶质分子大小进行分离的一种色谱法。 分类：按流动相类型不同分为：凝胶渗透色谱(GPC)：流动相为有机溶剂凝胶过滤色谱(GFC)：流动相为水溶液 适用：高分子物质的相对分子量分布以此鉴定高分子聚合物。三、高效液相色谱仪一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度混合装置、在线脱气机、自动进样器、溶剂管理器、预柱或保护柱、柱温控制器、自动馏分收集装置、工作站等。分离过程高压输液泵将贮液器中

9、的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。1.高压输液系统 贮液器 用途: 来提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析工作。要求：1、必须有足够的容积，以备重复分析时保证供液；2、脱气方便；3、能耐一定的压力；第四、所选用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。4. 贮液器一般是以不锈钢、玻璃、聚四氟乙稀或特种塑料聚醚醚酮 衬里为材料，容积一般为0.52L为宜。放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差。注意：密封、过滤 对流动相溶剂的一般要求

10、 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 适用于所选择的检测器。 化学惰性好，以免破坏固定相。 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。注意: 1.所有溶剂在放入贮液罐之前必须经过0.45m滤膜过滤，除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进样阀产生阻塞现象。2. 所有溶剂在使用前必须脱气 （2）高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。对于带有在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置后再输送到色谱柱。要求：由于高压输液泵的性能直接影响到分离分析结果的好坏，因此，实际分析过程中为了保证良

11、好的分离分析结果，要求高压输液泵必须满足以下几点要求：1、泵体材料能耐化学腐蚀；2、能在高压（3060MPa）下连续工作；3、输出流量稳定（1%），无脉冲，重复性高（0.5%），而且输出流量范围宽；4、适用于梯度洗脱。类型：恒压泵和恒流泵两大类 （3）过滤器在高压输液泵的进口和它的出口与进样阀之间，应设置过滤器。过滤器的滤芯是用不锈钢烧结构材料制造的，孔径为23m，耐有机溶剂的侵蚀。若发现过滤器堵塞（发生流量减小的现象），可将其浸入稀HNO3溶液中，在超声波清洗器中用超声波振荡1015min，即可将堵塞的固体杂质洗出。若清洗后仍不能达到要求，则应更换滤芯。（4）梯度洗脱装置 梯度洗脱：通过改变

12、流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。 梯度洗脱的特点：改善分离, 加快分析速度；改善峰形, 减少拖尾;可能引起基线漂移 类型：高压梯度与低压梯度2.进样系统 进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，要求密封性好，死体积小，重复性好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波动要很小。常用的进样器有以下二种：六通阀进样器和自动进样器3.分离系统分离系统的主要部件是色谱柱。一般要求：柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的。色谱柱管为内部抛光的不锈钢柱管或塑料柱管，色谱柱的种类 HPLC微粒填料：硅胶，以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球 填料粒度

13、：3m、5m、7m、10m等 柱效的理论值：500016000块理论塔板数 柱长：100300mm 柱内径：4.6 mm或3.9 mm常用保护柱：一般在色谱柱前要求安装保护柱，即在分析柱的入口端、装有与分析柱相同固定相的短柱（530mm长），可以经常而且方便地更换，因此，起到保护延长分析柱寿命的作用 色谱柱恒温系统： 由于分析的需要，色谱柱有时需要有一定的温度，提高柱温有利于降低溶剂粘度和提高样品溶解度，改变分离度，也是保留值重复稳定的必要条件，特别是对需要高精度测定保留体积的样品分析而言尤为重要。 高效液相色谱仪中常用的色谱柱恒温装置有水浴式、电加热式和恒温箱式三种。实际恒温过程中要求最高温

14、度不超过60，否则流动相气化会使分析工作无法进行。4. 检测系统u作用：连续监测被色谱系统分离后的柱流出物组成和含量变化的装置。其作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号，完成定性定量分析的任务。（2） HPLC检测器的要求 具有高灵敏度和可预测的响应； 对样品所有组分都有响应，或具有可预测的特异 性，适用范围广； 温度和流动相流速的变化对响应没有影响； 响应与流动相的组成无关，可作梯度洗脱； 死体积小，不造成柱外谱带扩展； 使用方便、可靠、耐用，易清洗和检修； 响应值随样品组分量的增加而线性增加，线性范围宽； 不破坏样品组分； 能对被检测的峰提供定性和定量信息； 响应时间足

15、够快。 （2）HPLC检测器的分类一般分为两类：1. 通用型检测器：可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化，通常采用差分测量法。这类检测器包括示差折光检测器、电导检测器和蒸发光散射检测器等。适用范围广，但灵敏度低，一般不能用于梯度洗脱。2. 专用型检测器：用以测量被分离样品组分某种特性的变化，这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器和安培检测器等。灵敏度高，一般可用于梯度洗脱，但应用范围受到一定限制。（3） 常用类型紫外-可见光检测器折光指数检测器荧光检测器蒸发激光散射检测器5.数据处理系统(色谱工作站) 高效液相色谱的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，现已广泛使用色谱数据处理机和色谱工作站来记录和处理色谱分析的数据。 三高效液相色谱的定量分析方法 1. 对仪器的一般要求 色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定； 除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器； 色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组