《实验——pcr》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验——pcr（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基本基本PCRPCR技术技术 质粒的三种构型和电泳结果质粒的三种构型和电泳结果l l有时仅能看到两有时仅能看到两个条带。个条带。l l本实验用的本实验用的pUC19pUC19质粒，大质粒，大小为小为 2686bp 2686bp。实验原理实验原理l l 在在PCRPCR反应体系中主要含有下列成分：反应体系中主要含有下列成分： 模板模板DNADNA； 寡核苷酸引物；寡核苷酸引物； dNTPdNTP（ATPATP、CTPCTP、TTPTTP、GTPGTP四种核苷酸的混合物）；四种核苷酸的混合物）； 高温高温DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqTaq酶）；酶）； MgMg2+2+l l PCRP
2、CR的基本反应步骤：的基本反应步骤： 变性变性 退火退火 延伸延伸 l l 反应最终的反应最终的DNA DNA 扩增量可用扩增量可用Y Y（1 1X X）n n计算。计算。Y Y代代 表表DNADNA片段扩增后的拷贝数，片段扩增后的拷贝数，X X表示平均每次的扩增表示平均每次的扩增 效率，效率，n n代表循环次数。代表循环次数。实验原理实验原理l l PCRPCR的基本反应步骤：的基本反应步骤： 变性变性 退火退火 延伸延伸实验原理实验原理l l 本实验所用的本实验所用的2 2 TaqTaq混合物，主要成分是：混合物，主要成分是： 0.1 U0.1 UTaqTaqDNADNA聚合酶聚合酶 50
3、0 500 M dNTPM dNTP 20 mM Tris-HCl (pH 8.3)20 mM Tris-HCl (pH 8.3) 100 mM KCl100 mM KCl 3 mM MgCl3 mM MgCl2 2 蓝色染料蓝色染料 其它稳定剂和增强剂其它稳定剂和增强剂l l 本实验所用引物，是按照大肠杆菌腺苷脱氨酶的基因本实验所用引物，是按照大肠杆菌腺苷脱氨酶的基因 设计，该基因的长度约设计，该基因的长度约1 kb1 kb。操作步骤操作步骤l l待检待检DNADNA模板的准备：取一干净离心管，加入模板的准备：取一干净离心管，加入9999 L L ddHddH2 2OO，再加入自己小组所提取
4、的，再加入自己小组所提取的K12sK12s基因组基因组1 1 L L， 使其稀释至使其稀释至1/1001/100。l lPCRPCR反应混合液的配制：取反应混合液的配制：取4 4个个200 200 L L离心管进行编离心管进行编 号，号，1 1管为阳性对照管；管为阳性对照管；2 2管为阴性对照管；管为阴性对照管；3 3 、4 4管为反应管。管为反应管。l l在在1 1管内，按照顺序加入下列成分（单位：管内，按照顺序加入下列成分（单位： L L）：）： dd Hdd H2 2O 7.5O 7.5 引物引物P1 1P1 1 引物引物P2P2 1 1 阳性对照模板阳性对照模板PT 0.5PT 0.5
5、 2 2 TaqTaq混合物混合物 1010 总体积总体积 2020l l2 2管内，以等体积管内，以等体积ddHddH2 2OO代替阳性对照模板；代替阳性对照模板；l l3 3、4 4管内，以等体积待检管内，以等体积待检DNADNA模板代替阳性对照模板代替阳性对照 模板，分别加入各试剂。模板，分别加入各试剂。操作步骤操作步骤l lPCRPCR反应：将上述反应：将上述PCRPCR小管插入小管插入PCRPCR仪内，按下列仪内，按下列程序运行：程序运行：9494预变性预变性5min5min3030个循环（个循环（9494变性变性30 s30 s；5555退火退火30 s30 s；7272延伸延伸8
6、0 s80 s）7272延长延长5 min5 min。l l结果检测：从结果检测：从4 4个反应小管内各取个反应小管内各取PCRPCR扩增产物扩增产物10 10 L L，在，在1.21.2的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。注意事项注意事项l l 每每吸取一个试剂，都要更换枪头，防止溶液的污染。吸取一个试剂，都要更换枪头，防止溶液的污染。l l 避免避免PCRPCR反应体系的污染。反应体系的污染。l l 加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回冰加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回冰浴浴。l l 往往PCRPCR中加入新的试剂时，把枪头伸入液面以下，反复中加入新的试剂时，把枪头伸入液面以下，反复吹吸以使溶液混合。吹吸以使溶液混合。l l 注意注意EBEB的的毒毒性性，小心避免污染小心避免污染。思考题思考题l l PCRPCR技术的原理是什么？技术的原理是什么？l l PCRPCR过程中，过程中，DNADNA的扩增是否可以无限进行？的扩增是否可以无限进行？ 下次实验下次实验l l DNADNA分子的限制性内切酶消化、片段纯化分子的限制性内切酶消化、片段纯化、连接、连接
