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1、基因治疗中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室 刘德培Definitions of Gene Therapy (1) 1984 Anderson WF: Gene therapy,the insertion into an organism of a normal gene which then corrects a genetic defect. 1990 Miller AD: Gene therapy is defined as the transfer of genetic material into the cells of an organism to treat
2、disease. 1991 Karisson S: Gene replacement therapy has been suggested for many single gene disorders using retroviral vectors as vehicles of gene transfer.Definitions of Gene Therapy (2) 1992 Anderson WF:Human gene therapy is a procedure that is being used in an attempting to treat genetic and other
3、 disease. A therapeutic technique in which a functioning gene is inserted into the somatic cells of a patient to correct an inborn genetic errors or to provide a new functions to the cell. The Definition of Gene TherapyVehicle基因治疗是采用基因转移的方法 将外源基因（治疗基因）导入细胞 并 在体内有效表达，以纠正或补偿 基因缺失或异常，从而达到治疗疾 病的一种新型疗法。基
4、因工程是将基因装配到载体上 并转移至特定细胞内，在体外扩增 并表达蛋白质产物的一种高技术。 某些表达产物可用于治疗疾病。基因治疗策略基因添加 病毒载体 非病毒载体DNA修复 同源重组基因定点修复RNA修复 剪接体修复 反式剪接基因治疗的难度1、疾病的预测、预防、诊断与治疗各有侧重、相辅相承、自身规律与特 点2、疑难病是对诊断、治疗两方面而言“不治之症”是对治疗而言3、基因治疗是对有严重危害的“不治之症 ”在分子水平上进行治疗 Gregor MendelExperiments with pea plantsExperiments with pea plants Law of Dominance
5、6.溶酶体储存障碍：葡萄糖脑苷酶缺乏； 7.其它代谢障碍：苯丙氨酸羟化酶缺乏；次黄嘌呤鸟苷磷酸核糖转移酶缺乏。Miller AD :Blood 1990; 76:271 ADA缺陷作为基因治疗的首选对象 选择影响DNA代谢与细胞分裂的突变，对突变的校正功能补偿可产生明显效应。 催化嘌呤代谢的三种酶缺陷符合要求:（ ADA, PNP, HGPRT） 骨髓移植方法治疗ADA缺陷中发现：治疗有效者受治一年后常恢复自身血细胞 ，只有T细胞例外，完全来自供体，说明：ADA正常的T细胞可用于治疗且有生长优 势。基因治疗与伦理学 讨论的必要性和超前性医疗新技术需经过伦理学检验 基因疗法充满希望与潜在危险 社
6、会已不再满足于仅接受教训 新技术应具可预见性与可控性 需要全面系统深入讨论伦理学 这种讨论在某些情况下应超前新疗法新三部曲奔走相告详述曲衷灰心丧气较少发生正确评价贯穿始终基因治疗的伦理学基本问题 目的性： 治疗人类疾病，不为增加聪明与强 壮 生殖细胞介导：结果能传代随机整合使人类基因库紊乱实现高效定点修复可考虑 体细胞介导： 结果不传代只影响受试者本人需权衡作用与潜在危险体细胞基因治疗 伦理学问题转化为常规问题由此产生体细胞基因治疗的三点要求 1、治疗前让患者与家属充分理解并征得同意 2、预期估计疗效需远大于潜在危险性 3、列出方案需经专门机构严格审批 （知情同意，有利不伤害）基因治疗受试者的
7、选择1.对“致病基因”的不同理解，镰状贫血突变与疟疾相关 2. 晚期癌症等濒危患者的“适应性”问题 3.“非绝症患者不宜被选为受试者”问题 4. 有无知情同意能力的人作为受试者问题有无知情同意能力的人作为受试者1.对受试者选择需得到伦理审查委员会的 审查与监督 2.尽可能选择有知情同意能力的受试者 3.对无知情同意能力者需得到法定监护人 员知情同意，儿童拒绝参与研究必须得 到尊重。 4.严格实施知情同意，充分进行风险-受益 分析，坚持基因治疗“优后”原则。实施知情同意原则时存在的问题1.信息的不完全性与可变性 2.不同科学文化程度产生的理解与同意程度的差异性 3.不同文化背景对知情同意的不同观
8、念 4.不同角色与不同程度的包办代替基因治疗的审批1.研究者、医护工作者资格审查 2. 受试者适应性审查与例数 3.项目的安全性审查：材料、方法 4.项目的可行性与有效性：动物模型结果 与疗效预测、风险与受益分析和“优后” 原则人类基因标记 （Human Gene Marker)基因标记是基因治疗的准备工作接受标记实验的患者不一定直接受益审批手续与临床基因治疗相同。由标记实验回答两个基本问题：1、外源基因能否安全地转移到患者体内2、取自体内的细胞能否检测外源基因的存在 为临床基因治疗提供有用的信息第一例基因标记（NEO/TIL方案（1989，5，22，NIH）恶性黑色素瘤肿瘤组织分离 肿瘤浸润
9、的淋巴细胞（TIL）TIL TILRV-NEO, 培养 培养 标记的TIL TIL恶性黑色素瘤患者本人体内 细胞专门攻击肿瘤组织1990: the first successful one ADA Gene TherapyHum. Gene Ther. 1:327,1990 Science 270:470,1995 Science 270:475,1995 Hum. Gene Ther. 13:1605, 2002Severe combined immunodeficiency caused by mutation in adenosine deaminase gene in T cells
10、. The first successful gene therapy on humans was performed in 1990 by Drs. W. French Anderson, Michael Blaese and Ken Culver, researchers at the National Institutes of Health. The four-year-old Ashanthi DeSilva was treated for adenosine deaminase (ADA) deficiency, a rare genetic disease in which ch
11、ildren are born with severe immunodeficiency and are prone to repeated serious infections.ADA Gene TherapyIsolate mononuclear cells; induce T cell replication; infect with retrovirus (LASN-ADA-NeoR) Infuse the gene corrected T cell back to patientsExperimental ProtocolMoloney leukemia virus LTRpacka
12、ging signalADAneoLTRLTRSV40Ashanti de Silva第一例肿瘤基因治疗（TNF/TIL)(1991，1，29， NIH) 恶性黑色素瘤患者的肿瘤组织分离 TIL细胞IL-2，培养RV-TNF转染 TNF/TIL细胞输回 恶性黑色素瘤患者本人体内， TIL细胞可在肿瘤组织安家， 产生局部高浓度TNF以杀死肿瘤但不带来严重的副作用 人类对TNF耐受剂量较小（8ug/Kg）血友病B的基因治疗 （1991、12、3 上海长海医院）血友病B患者离体皮肤成纤维细胞RV-Factor IX 受转染的成纤维细胞克隆筛选 分泌IX因子蛋白的皮肤成纤维细胞胶原包埋注入患者本人皮下
13、 生化检测和临床观察两例血友病B基因治疗结果患者1患者2受转染离体细胞IX因子蛋白分泌率 （ng/细胞/24小时）300400血浆IX因子浓度 治疗前（ng/ml） 治疗后130 25070 240凝血活性 治疗前（） 治疗后未改变2.9% 6.3%出血症状明显改善Nature Reviews Genetics 4, 346 -358 (2003)Drawbacks of virus system Immunogenicity and cyototoxicity: the inflammatory reaction to adenovirus vector Insertional mutage
14、nesis: the ectopic chromosomal integration of viral DNA either disrupts the expression of a tumor- suppressor gene or activated an oncogene.Fall 1999Jesse Gelsinger - teenage boy with mosaic ornithine transcarbamylase deficiencySingle hepatic artery infusion of 2nd generationadenoviral vectorWithin
15、12 hrs - fever, low plateletsWithin 3 days death from Systemic InflammatoryResponse SyndromeInvestigation Outcome: -Vector not only delivered gene to liver but to other tissue. -Triggered systemic inflammatory response. -Patient acquired fever, coma, death.Reasons: -Animal studies suggested dose was OK (?). -Adenoviral vectors known to induce inflammatory response. -Patient already compro
