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1、第四章 微生物检验基础技术阳江职业技术学院 授课教师：钟旭美微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 微生物一般都是很小的生物体，通过染色的方法，可以强化细胞或细胞组分与周围环境之间的反差，是利用普通光学显微镜来观察微生物细胞的简捷方法。通过本节染色技术的学习，可了解染色的原理，掌握制作简单装片的技能，各种染色方法的基本操作，通过对染色标本的观察，我们会更熟练地使用显微镜。微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术媒媒 染染染染 色色固固 定定干干 燥燥涂涂 片片一、 染色的基本程序脱脱 色色复复 染染微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节
2、 染色与细菌的形态观察技术v 在洁净无油脂的载玻片上滴上一滴生理 盐水（如果是液体菌悬液，则可不滴）; v 用灭菌接种环挑取菌落少许至载玻片的 生理盐水内并轻轻涂布成薄薄的菌膜。若 是菌液标本，则用无菌接种针直接涂布成 菌膜。涂涂 片片微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v涂布的标本，一般在室温下自然干燥，若 需加速干燥，则可在酒精灯火焰上方利用 其热空气加温，切忌火烤和温度过高。干干 燥燥微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v标本在未染色之前须进行固定。固定的目 的主要是杀死细胞，让细胞物质凝固并使 细胞粘附在玻片上。细菌的固定常用
3、的也 是火焰加热法。将干燥涂片迅速通过火焰 2 3 次，温度不宜过高，以玻片背面触 及皮肤有热感而不烫手为度。固固 定定微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v染色的目的是增大标本与环境的反差，便 于在显微镜下观察。以普通涂片标本的染 色为例，就是将所需染色液滴加在标本上 ，以覆盖涂膜为够，达到所需染色时间， 倾去染液，水洗，吸干即成。染染 色色微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v有的染色还需要增加媒染剂，以增大染料 与被检标本物质的亲和力或使染料更好地 固定于被染标本。媒染剂可用于细菌标本 固定之后，也可包含在固定剂或染色液中 。革
4、兰氏染色中的路哥氏碘液就是媒染剂 。媒媒 染染微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 使着色的染料脱去颜色称为脱色，能脱色的物质 称为脱色剂。在染色中，使用脱色剂的作用有的 是起溶媒作用，有的是影响细菌蛋白质的电离度 ，改变电荷的性质和数量，因而影响染料的染色 质量。利用脱色剂主要是检查染料与细菌结合的 稳定程度，作为鉴别染色之用。如革兰氏染色使 用乙醇（95左右乙醇，脱色作用最大），就是 鉴别不同细菌。使用脱色剂时，就是将脱色剂滴 加在经过染色的标本上，作用一定的时间后，倾 去脱色剂，水洗即成。有的脱色一定要掌握好时 间，否则不能达到理想目的。脱脱 色色微生物检
5、验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v在进行鉴别染色时，已经进行过脱色的标 本，常需用复染剂重复染色一次，使复染 剂与初染颜色形成鲜明对比。复染不宜太 强，以免覆盖初染颜色。复复 染染微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 简单染色流程：涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检v 革兰氏染色流程：涂片 干燥 固定 初染 水洗 媒染 水洗 脱色 水洗 复染 水洗 干燥 镜检v 芽孢染色流程：涂片 干燥 固定 染色 水洗 复染 水洗干燥 镜检二、几种常用的细菌染色法二、几种常用的细菌染色法微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态
6、观察技术v 荚膜染色法流程：涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检v 鞭毛染色法流程：涂片 干燥 固定 A 染初染 B 染复染 水洗 干燥 镜检二、几种常用的细菌染色法二、几种常用的细菌染色法微生物检验基础技术阳江职业技术学院v 简单染色简单染色法又叫普通染色法，是只用单一种染料进行的染 色。染料选择： 碱性染料：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 使用条件：一般情况下简单染色都用碱性染料。 酸性染料：伊红、酸性复红或刚果红等。 使用条件：培养基 pH 下降时。第一节 染色与细菌的形态观察技术微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 革兰氏染色的原理G+菌 G-菌等电点
7、PI 23 PI 45带负电荷多 带负电荷少通透性 低 高肽聚糖多，脂质少 肽聚糖少，脂质多酒精不易进入 酒精易进入微生物检验基础技术阳江职业技术学院微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 革兰氏染色的意义鉴别细菌：分成G+菌和G菌选择药物：G+菌和G菌对抗菌药物敏感性不一样v 与致病性有关：G+ 菌产生外毒素G菌产生内毒素微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v革兰氏染色过程涂片涂片 无菌操作取菌适量涂均匀无菌操作取菌适量涂均匀干燥干燥固定固定 初染初染 草酸按结晶紫草酸按结晶紫染色染色1min1min水洗水洗 洗至水无色洗至水无色媒
8、染媒染 碘液染色碘液染色1min1min水洗水洗 洗至水无色洗至水无色脱色脱色 9595乙醇脱色，乙醇脱色，202030s30s。水洗水洗 洗至水无色洗至水无色复染复染 番红染液复染约番红染液复染约1.5min1.5min水洗水洗 洗至水无色洗至水无色干燥干燥 风干风干镜检镜检 判断阴、阳性，观察形态判断阴、阳性，观察形态风干，勿火烤，勿高温风干，勿火烤，勿高温微生物检验基础技术阳江职业技术学院接种环冷却微生物检验基础技术阳江职业技术学院革兰氏染色法 Gram stain菌1菌1+ 菌2菌2涂片菌1方法一方法二微生物检验基础技术阳江职业技术学院微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细
9、菌的形态观察技术v 微生物革兰氏染色图片大肠杆菌微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 微生物革兰氏染色图片大肠杆菌金黄色葡萄球菌微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 微生物革兰氏染色图片奶粉中分离菌微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 微生物革兰氏染色图片炭疽芽胞杆菌微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术v 微生物革兰氏染色图片链球菌微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术染色基本原理v用着色力强的染色剂孔雀绿在加热条件下染色， 使染料不仅进入菌
10、体也可以进入芽孢内，进入菌 体的染料经水洗后被脱色，而进入芽孢一经着色 则很难被水洗脱色。当用复染剂染色后，芽孢仍 保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染 剂的颜色，使芽孢和菌体更容易区分。芽孢染色法微生物检验基础技术阳江职业技术学院芽孢染色法方法与步骤 （1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 （3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌勿使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6）染10分钟。（4）倾去染液，
11、待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。 （5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。微生物检验基础技术阳江职业技术学院第一节 染色与细菌的形态观察技术芽孢染色微生物检验基础技术阳江职业技术学院鞭毛染色法 细菌的鞭毛极细，直径一般为1020nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。 第一节 染色与细菌的形态观察技术微生物
12、检验基础技术阳江职业技术学院鞭毛染色法步骤v 1、菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的培养基斜面上连续 移接35代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒 温箱中培养1216h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝 水交接处的菌液数环，移至盛有1 2mL无菌水的试管 中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37恒温箱中静 置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片 的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用 吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。方法一方法一微生物检验基础技术阳江职业技术学院v
13、 2、染色滴加A液，染4 6min。用蒸馏水充分洗净A液。用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上 加热至冒气，约维持0.5 1min（加热时应随时补充 蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。用蒸馏水洗，自然干燥。v 3、镜检先低倍，再高倍，最后用油镜检查。v 结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。鞭毛染色法步骤微生物检验基础技术阳江职业技术学院改良Leifson染色法 v 1、配制染料： 染料配好后要过滤15-20次后染色效果才好。 v 2、菌液的制备及涂片菌液的制备同1。用记号笔在洁净的玻片上划分34个相等的区域。放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并 用滤纸吸
14、去多余的菌液。在空气中自然干燥。 v 3、染色：加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加 入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的 染色时间，而且节约材料。 v 4、水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则 会增加背景的沉淀。 v 5、干燥：自然干燥。 v 6、镜检： 先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多 找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。 v 结果：菌体和鞭毛均染成红色。鞭毛染色法步骤方法二方法二微生物检验基础技术阳江职业技术学院鞭毛染色法注意事项 v 1. 方法一比较容易掌握，但染色液必须每次现配
15、现用，不 能存放，比较麻烦。 v 2.方法二受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须 经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。 v 3.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔 细小心，以防鞭毛脱落。 v 4.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。 v 5.大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛， 弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较 强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼 龄菌体。微生物检验基础技术阳江职业技术学院第二节 放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察基本原理 v 放线菌的菌落在培养基上着生牢固，与基质结合紧密，难 以用接种针挑取。 v 放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，纤细的菌丝体分为在 培养基内部的基内菌丝和伸出培养基表面的
