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1、第九次实验肠道杆菌学习要求l观察肠道杆菌的形态染色l观察肠道杆菌在SS培养基上的生长情况及 菌落特征。l掌握鉴别肠道杆菌的主要生化反应l熟悉肥达反应的操作方法，掌握判定肥达 反应结果的方法。 实验内容1、肠道杆菌形态观察（革兰染色、油镜观察）（每人做）大肠杆菌 伤寒杆菌 痢疾杆菌 变形杆菌2、 肠道杆菌的培养SS平板、双糖铁培养基（示教）大肠杆菌 伤寒杆菌 痢疾杆菌 变形杆菌3、 肠道杆菌的接种SS平板、双糖铁培养基（每组做一份）4、 肠道杆菌的生化反应 I M Vi C （示教）5、肠道杆菌的血清学试验 肥达（Widal）反应（示教）6、肠道杆菌的检查(录像)33痢疾杆菌伤寒杆菌大肠杆菌大肠
2、杆菌（非致病菌）在SS培养基上可形成 相对较大，不透明，红色的菌落。致病性肠道杆菌在SS培养基上形成相对较 小，半透明，无色或淡黄色的菌落。SS平板：为强选择性培养基，内含胆盐、枸橼酸钠和 煌绿，可抑制大肠杆菌和非肠道杆菌的生长；还含有 乳糖和中性红，一般肠道致病菌不分解乳糖，但分解 蛋白胨，产生碱性物质，故菌落呈淡黄色。大肠杆菌 发酵乳糖，产酸使指示剂变红，故菌落呈红色。该培养基含葡萄糖、乳糖、硫酸亚铁。指示剂为 酚红。葡萄糖与乳糖的比例为1:10。 若细菌分葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面与底层 均呈黄色，且有气泡。若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖,分解葡萄糖后 所生成的少量酸可使底层pH降低；
3、而上层少量酸因接 触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成 碱性化合物，呈红色。若细菌产生硫化氢时与培养基中硫酸亚铁作用,形 成黑色的硫化铁呈黑色。配合半固体培养基可观察肠道杆菌中的细菌动力 。I M Vi C :鉴别肠道杆菌的四种常用方法例如 大肠杆菌的结果为：+ + - -产气杆菌的结果为：- - + +I 靛基质试验（吲哚试验）：某些细菌具有 色氨酸酶，可以分解蛋白胨的色氨酸生成靛 基质，也称吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛作 用生成红色的玫瑰吲哚（阳性）。 玫瑰吲哚M 甲基红（MP）试验： 细菌在糖代谢过程中，分 解葡萄糖产生丙酮酸，丙 酮酸进一步分解为甲酸、 乙酸、乳酸等，使培养基
4、的PH值下降到4.5以下时， 加入甲基红呈红色为阳性 。如细菌分解葡萄糖产酸 量甚少，或产生的酸进一 步转化为其他物质时，PH 值到5.4以上，甲基红呈橘 黄色为阴性。Vi VP试验：一些细菌能使丙酮酸脱羧生成中 性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化成二乙 酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是 为VP试验阳性，某些细菌不能产生乙酰甲基甲醇，是 为VP试验阴性。C 枸橼酸盐利用试验：某些细菌可以通过枸橼酸 酶分解枸橼酸盐生成碱性碳酸盐和碳酸氢盐，使培 养基变碱，则溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝 色，其他细菌不能分解枸橼酸盐，得不到碳源不能 生长，指示剂也就不会变色。 原理：肥达试
5、验是用已知的伤寒沙门菌菌体 （O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副 伤寒的甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌和希 氏沙门菌的H抗原的诊断菌液与受检血清作 试管凝集试验，测定受检血清中有无相应抗 体及其效价的试验。操作程序及结果观察肥达试验结果的解释必须结合临床表现 、病程、病史等。肥达（Widal）反应操作程序 1将试管排成5排，每排7支，标记序号。 2第一排每支试管内加入0.5ml生理盐水。取1:10稀释 的待检血清0.5ml加入第一管，充分混匀，移出0.5ml至 第二管，混匀后移出0.5ml至第三管，如此倍比稀释， 直至第六管，得到稀释度为1:20、1:40、1:80、1:160、 1:320、
6、1:640血清。 3第二、三、四、五各排试管按步骤2方法稀释血清。 4加入菌液：第一排各管加人伤寒杆菌“H”菌液0.5ml ；第二排各管加人伤寒杆菌“O”菌液0.5ml；第三排各管 加人副伤寒杆菌甲“H”菌液0.5ml；第四排各管加人副伤 寒杆菌乙“H”菌液0.5ml；第五排各管加人副伤寒杆菌丙 “H”菌液0.5ml。因此各管血清稀度分别为1:40、1:80、 1:160、l:320、1:640、1:1280，各排第七管均为本排菌 液对照管，每管液体总量为1ml。 5振摇试管架后，置于37水浴箱中过夜，次日观察 结果。 6从水浴中轻轻取出试管架，不要振荡。 先观察对 照管，不应出现凝集现象，再观察各管凝集情况。 “H”凝集呈絮状，以疏松大团沉于管底；“O”凝集呈 颗粒状，以坚实凝片沉于管底。 凝集程度判定以“”、“”号表示如下：+上清完全透明，细菌全部形成凝集块；+ 细菌绝大部分凝集，液体有轻度混浊；+ 50细菌形成凝集，液体半澄清；+ 仅少量细菌凝集，液体比较混浊;液体均匀混浊，无凝集（部分菌体因静置而沉 于管底，经摇后如云烟状升起，很快消失）。 以呈现+ + 凝集的血清最高稀释度作为该血清的凝 集效价。 结果判断：小结：1.肠道杆菌的形态染色以及在SS培养 基上的生长情况。2.肠道杆菌的生化鉴定方法： IMViC及双糖铁培养基3.肥达反应
