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1、 RNA 相关操作技术RNA相关技术主要包括： RNA 提取、电泳技术 RNA逆转录合成cDNA 体外转录合成RNA RNA杂交Northern杂交 原位杂交技术 基因芯片技术 cDNA文库的构建RNA概述细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中：80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA 的1%-5%rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断
2、。OD260为1时相当于浓度为40g/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。1、mRNA的分离纯化PolyA T-tract mRNA的 分离纯化过程简图。2、逆转录合成cDNA构建cDNA文库3、Northern 杂交技术基本原理：Northern杂交是研究真核细胞基因表达的基本方法。其基本原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。主要用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（
3、mRNA）及其含量。 Northern杂交基本操作流程1）RNA变性及电泳 氢氧化甲基汞（很好的变性剂，但具有挥发性，且有毒） 乙二醛醛/甲酰酰胺 甲醛醛和甲酰胺对对RNA进进行预处预处 理，后在含2.2M甲醛醛的凝胶中电电泳2）RNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 3）核酸探针的标记及杂交 4）洗膜与检测4、RNA原位杂交技术（in situ hybridization, ISH）RNA原位杂交用放射性或非放射性（如DIG、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性
4、定量分析。mRNA的互补链，杂 交信号集中于纤维 细胞中。负对照，mRNA 的同义链, 无 杂交信号。正对照，UBQ10 杂交信号遍布 于整个胚珠。RNA原位杂交基本操作流程（一）用石蜡包埋材料1）材料的固定： 固定液：FAA固定液、多聚甲醛固定液 固定的材料不宜过过大，否则则固定液不易渗透 抽气：抽气、放气宜缓缓，尽量避免对细对细 胞造成伤伤害 材料在固定液中浸泡的时间时间 不宜过长过长 ，否则杂则杂 交信号会减弱2）脱水将乙醇或戊二醇配制成由低到高的浓度梯度，对固定好的材料进行逐级处理。如： 50%乙醇70%乙醇85%乙醇90%乙醇100%乙醇3）透明完全脱水的材料经下列二甲苯梯度处理（用
5、乙醇配制）25%，1h50%，1h75%，1h100%，1h，重复两次4）包埋将石蜡切成小碎片，加入到材料中（浸泡在二甲苯中）至饱和，42放置一天，5860 放置两天，期间换34次石蜡，最后将材料和石蜡一起倒入小纸盒中，凝固后，4 保存。（二）切片和展片切片厚度710 微米（三）探针的制备体外转录合成sense探针、antisense探针（DIG RNAlabeling kit），探针浓度100400ng/ul为宜（四）材料脱蜡和复水脱蜡：100%二甲苯33%二甲苯复水： 100%乙醇10%乙醇水（五）杂交杂交液由A和B组成，每张片子大约需100150ul杂交液；在0.3M NaCl-50%甲
6、酰胺溶液形成的湿室中，42杂交过夜。（六）洗片用RNase A对材料进行处理（七）显色加入anti-DIG-Ap，进行显色；镜检，拍照蛋白相关操作技术一、蛋白与DNA相互作用 （一）酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）该技术是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中 DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。基本原理：将顺式作用元件与最基本启动子（minimal promoter，Pmin）相连并将报告基因连到Pmin下游，将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域（t
7、ranscription-activating domain, AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活Pmin启动子，报告基因表达。 从拟南芥cDNA文 库中筛选与顺式元 件DRE结合的转录 因子示意图。（二）噬菌体展示技术基本原理：将已知的启动子DNA片段与固相支持物结合；以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段（编码启动子 DNA结合蛋白的cDNA）定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，形 成的融合蛋白表达在噬菌的表面，不影响噬菌体的生活周期及 天然构型。外源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面，与固定或固 相支持物结合，通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体( 即亲
8、和富集法)，选出目的噬菌体，而编码基因作为病毒基因组 的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序得知. （三）DNAase I 足迹实验足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而 且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位，足迹试验的方法较 多，常用的有DNase 足迹试验、硫酸二甲酯足迹试验 (dimethylsulfate，DMS)，二者原理基本相同. DNase 足迹试验的基本原理为: 蛋白结合在DNA片段上，保 护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下 了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质 结合的部位没有放射性标记条带。技术流程为： (1)待检双
9、链DNA分子用P32作末端标记，通常只标记一端; (2)蛋白质与DNA混合，等二者结合后，加入适量的DNase ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设未加蛋白质的对照; (3)从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列.（四）CHIP (Chromatin Immunoprecipitation)染色质免疫沉淀技术, 一种可用来确定与某一特定蛋白结合 或蛋白定位所在的特异性DNA序列的技术（五）EMSA (电泳迁移率实验)一、蛋白与蛋白相互作用 （一）酵母双杂交系统（Yeas
10、t two-hybrid system）真核生物转录调控因子具有组件式结构特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。 BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。酵母双杂交技术原理示意图 （二）GST pull-down技术基本原理：将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”；目的蛋白溶液过柱,可从中捕获
11、与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。GST融合蛋白沉降技术流程。 （三）免疫共沉淀技术（coimmunoprecipitation，Co-IP）非变 性 裂 解完整细胞时，胞内许多蛋白质间的结合状态可以保持下来。如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，则在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理性相互作用，被称为免疫共沉淀。在实际应用中常用融合表达的带有蛋白标签的特异性抗体与目标蛋
12、白质或蛋白复合物结合，形成蛋白复合物沉淀。免疫共沉淀 示意图 （四）荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究。目前FRET技术中常用的荧光蛋白对是YFP和CFP,当与荧光基团融合的被研究蛋白发相互作用时，荧光基团在空间上靠近，发生能量转移，通过检测供受体分子发射程度比率的变化就可得知蛋白质结合程度的强弱。（五）双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)基本原理：方法利用绿色荧光蛋白(green flu
13、orescent protein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱等情况。 （六）蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点 。Gong W. et al. (2008) Molecular Plant1: 27-41.其它蛋白互作技术串联亲和纯化（TAP）表面等离子共振（SPR）噬菌体展示技术(phage display approach)融合蛋白亲和色谱法(protein fusion affinity chromatography) 原子作用力显微技术(atomic force microscopy,AFM )
