第十一章 微生物与基因工程.ppt

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1、第十一章 微生物与基因工程第一节 基因工程的诞生第二节 目的基因的分离第三节 微生物与克隆载体第四节 微生物与基因工程工具酶本章主要内容基因工程诞生于1973年，在现代分子生物学 领域理论上的三大发现及技术上的三大发明 对基因工程的诞生起到了决定性的作用。第一节 基因工程的诞生一 理论上的三大发现二 技术上三大发明三 基因工程的基本过程四 微生物与基因工程的关系一 理论上的三大发现（1） 40年代发现了生物的遗传物质是DNA。 Avery不仅证明DNA是生物的遗传物质，而且也证明了 DNA可以把一个细菌的性状转 给另一个细菌，理论意义十分 重大。正如诺贝尔奖金获得者 Ledeberg指出的，A

2、very的工 作是现代生物科学的革命开端 ，也可以说是基因工程的先导 。1944年，Avery等从分子水平上研究证实转化因子是DNA。l1928年，英国 Griffith 肺炎双球菌的转化实验。（2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。l1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺 旋模型。对生命科学的发展，足以和达尔文学 说、盂德尔定律相提并论。 哈佛大学生物系教授Matthew Meselson和他的学生 Franklin Stahl用实验证明了DNA是按半保留方式 进行复制的。（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷

3、酸 组成一个密码子，代表一个氨基酸。1966年，破译了64个密码子，编排了一本密码字 典，叙述了中心法则。从此，千百年来神秘的遗传现 象，在分子水平上得到了揭示。 二 技术上的三大发明(2)DNA连接酶的发现 (3)基因工程载体的发现 (1)限制性核酸内切酶的发现n从40年代到60年代，虽然从理论上已经确立了基因工程的可能性，科学家们也为基因工程设计了一幅美好的蓝图。但是，科学家们面对着庞大的dsDNA，尤其是真核生物，其DNA分子是相当巨大的，仍然是束手无策，不能把它切成单个的基因片段。n1970年，流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind III。n1972年Boyer实验室又发

4、现了名叫EcoR I的核酸内切酶。n1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。这种酶能够参与DNA缺口的修复。1970年，美国的Khorana实验室发现了一种叫T4 DNA连接酶，具有更高的连接活性。 n科学家有了对DNA切割与连接的工具，还不能完成DNA体外重组的工作。因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。所以，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DNA片段连接到一种特定的、具有自我复制的DNA分子上。这种DNA 分子就是基因工程载体(Vector)。 n1946，Lederberg开始研究细菌的性因子 (F因子)，经过50和60年代，相继发现其它 质粒，如抗药性因子(R

5、因子)，大肠杆菌素 因子(CoE)。n1972年，美国斯坦福大学的P.Berg领导的研究 小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组 。n他们使用限制性内切酶EcoRI，在体外对猿猴病 毒SV40的DNA和噬菌体的DNA分别进行酶切，然 后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起 来，结果获得了包含有SV40和DNA重组的杂种 DNA分子。（基因工程的雏形） n1973，Cohen将质粒作为基因工程的载体使用 。n具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞 生的条件已经成熟。n两位科学的“助产士Berg和Cohen把基因工程接到了人间。n基因工程诞生的元年。 In 1973, H.Bo

6、yer & S.Cohen, 1st use of plasmid to clone DNA1.目的基因分离或合成 2.通过体外重组将基因插入载体 3.将重组DNA导入细胞 4.扩增克隆的基因 5.筛选重组体克隆 6.对克隆的基因进行鉴定和测序 7.控制外源基因的表达8.得到基因产物或转基因动物、转基因植物三 基因工程的基本过程四 微生物与基因工程的关系基因工程的一切操作都离不开微生物！1 基因资源2 基因工程载体3 基因工程工具酶4 基因工程的宿主5 基因表达生物反应器6 基因工程的理论研究第二节 目的基因的分离一 基因文库分离目的基因二 基因的化学合成三 PCR扩增基因四 基因的定位诱变一

7、 基因文库分离目的基因基因文库(gene library) 是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑)(或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。 基因文库构建包括以下基本程序： DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。 载体的选择及制备。 DNA片段或cDNA与载体连接。 重组体转化宿主细胞。 转化细胞的筛选。 基因文库的类别1.基因组文库与cDNA文库2.克隆文库及表达文库3.不同载体的基因文库n 基因组文库是指将某生物的全

8、部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。n cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。ncDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含 有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因n 基因组文库构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性，在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。二 基因的化学合成n这种方法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小 的目的基因的制备。n从最初只能人工合成15bp的寡核苷酸片段，到目前

9、可 以利用自动合成程序合成长达200bp的寡核苷酸片段。利用DNA连接酶的作用，甚至可以合成和组装更长的基因片 段。到目前为止，已经成功地合成了数十种基因。目前 基因合成更多的是由DNA自动合成仪来完成。n 1967年，HGKhorana就提出了用化学方法合成基因的想法，并进行了实践。1979年，Khorana在美国 “Science”杂志上发表了题为一个基因的合成的著 名论文，报道了基因化学合成的成功事例。目前已发展 的有关寡核苷酸片段的化学合成方法有磷酸二酯法、磷 酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化法。寡核苷酸化学合成的实际用途n (1)作为合成基因的元件n (2)作为核苷酸序列分

10、析的引物n (3)作为核酸分子杂交的探针n (4)用于基因定点诱变研究 n (5)作为PCR扩增反应的引物n (6)作为重组DNA连接构件三 PCR扩增基因PCR技术在基因克隆方面的应用n1)目的基因的直接克隆n2)通过RT-PCR进行cDNA的克隆n3)制备DNA探针，进行分子检测等n4)cDNA末端的快速克隆RACE PCRn5)反向PCR克隆目的基因侧翼序列四 基因的定位诱变我们需要：研究特定基因中发生突变的效应。如何做到？办法：DNA的位点专一性诱变（site-directed mutagenesis）核心：创造点突变，或小片段的缺失和插入。1） 制备某个基因或部分基因片段的克隆。DN

11、A变性。 2） 人工合成一段短的DNA片段（寡核苷酸），与克隆的DNA部分区域互补。3） 合成的DNA与克隆的DNA配对。 4） DNA聚合酶以合成的DNA为引物，合成一段完全互补的环状模板链。5） DNA连接酶催化新链形成环状分子。 6） 转化，将DNA引入细胞中。寡核苷酸指导的定位诱变程序第三节 微生物与克隆载体一 质粒载体二 病毒、柯斯质粒载体三 人工染色体克隆载体质粒载体是存在于宿主染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有13个抗药性基因，以利于筛选。1 质粒的一般生物学特性n 广泛存在于细菌细胞和酵母细胞中，甚至是在真核生物的细胞器（线粒体）中。 n 自主复制，独立

12、遗传的辅助性遗传单位。 n 其复制和转录依赖于宿主编码的酶和蛋白质。 n 结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无胞外的生命周期。2 质粒载体的基本条件质粒载体绝大多数是以天然质粒为基础，人工改造和组建 形成的实用载体。可根据不同的实验要求，加以选择。(1) 能自主复制，即本身是复制子(含有复制起点）； (2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位 点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；(3) 在基因组中有12个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。 pBR322质粒载体4361bppUC系列的质粒载体pUC系列载体是在pBR322质粒

13、载体的基础上，组入了一个 带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功 能检测特性的新型质粒载体系列。此类质粒载体之所以取名为pUC，是因为它是由美国加利 福尼亚大学(University of California)的科学家 J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建的。pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；2)氨苄青霉素抗性基因(Ampr)；3)大肠杆菌半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编 码肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；4)位于lacZ基因中的靠近5端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple

14、cloning sites)区，但它并不破坏 该基因的功能(图)。EcoRISacIKpnIXmaI SmaIBamHIXbaISalI HincII AccIIBspMIPstISphIHindIII2.686kb2.0k1.0kpUC19oriPolylinkerAmpRlacZ+ lacIpUC系列质粒载体的优点与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体系列具有许多方 面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆 菌克隆载体之一。1)具有更小的分子量和更高的拷贝数 2)适用于组织化学方法检测重组体3)具有多克隆位点MCS区pGEM系列载体pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分

15、子的质粒载体。在其总长度为2 743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。pGEM系列载体与pUC系列之间主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ基因中多克隆位点区的两侧(图)，故若在反应试管中加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，那么克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。第四节 微生物与基因工程工具酶一 限制性内切酶二 DNA连接酶三 DNA聚合酶

16、四 逆转录酶n基因操作包括以DNA分子的切割和连接为核心 的一系列步骤，需要多种具有不同功能的工具酶 参与完成。以限制性内切酶 (restrictionendonuclease)和DNA连接酶 (1igase)为主的多种工具酶的发现和应用，为基 因操作提供了十分重要的技术基础。 一 限制性核酸内切酶n限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的 某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内 切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据 1994年美国出版的分子生物学百科全书的统计数字 ，仅型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微 生物当中，分离出了2 300种以上，可识别230种不同的 DNA序列。1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶。1970年 美国约翰霍布金斯大学H.Smith偶然发现 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体DNA，但不能降解自身DNA ，