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1、http:/ 生物化学与分子生物学实验教学示范中心生物化学与分子生物学实验教学示范中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular BiologyExpertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biologyhttp:/ ,是进行是进行RNARNA 方面的研究工作如方面的研究工作如 NothernNothern杂交、杂交、mRNAmRNA分离、分离、RT-PCRRT-PCR、定量、定量PCRPCR、cDNAcDNA合成合成 及体外翻译等的前提。及体
2、外翻译等的前提。pp掌握从细胞中提取总掌握从细胞中提取总RNARNA的方法的方法pp熟悉紫外吸收法检测熟悉紫外吸收法检测RNARNA浓度与纯度的原理及测定方法浓度与纯度的原理及测定方法pp掌握掌握RT-PCRRT-PCR基因扩增的原理和过程基因扩增的原理和过程目目 的的http:/ 操作步骤操作步骤逆转录原理逆转录原理 操作步骤操作步骤提提 取取 总总RNARNA定定 量量合成合成cDNAcDNA 第一链第一链原理体系原理体系 引物选择引物选择PCRPCR电泳原理电泳原理 电泳步骤电泳步骤电电 泳泳计算方法计算方法 操作步骤操作步骤http:/ 细胞总RNA的提取及定量Extraction a
3、nd Quantitation of Cell Total RNAExtraction and Quantitation of Cell Total RNA http:/ 关关 键键 点点http:/ 理理p10-5g RNA/细胞 pRNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍-有机溶 剂法；氯化锂-尿素法；蛋白酶K-细胞质RNA提取法；异硫氰酸胍- 酚-氯仿一步法(Trizol法)等。p目前常用的是Trizol法。rRNArRNA 80-85% 80-85%：28S 18S 5S28S 18S 5StRNAtRNA, , snRNAsnRNA 10-15% 10-15%mRNA 1
4、-5%mRNA 1-5%http:/ 理理pTrizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂p其主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。p酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。http:/ 有机相。RNA在上层水相中，DNA和蛋白质位于中间层，有颜色 的下层为有机相。p取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收 DNA。原原 理理http:/ p最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各
5、种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。http:/ （DEPC) 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2.异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白体中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin) 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 4.其他 SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。http:/ 1.所有的玻璃
6、器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。 2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 4.配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。http:/ 样品处理p提取组织RNA时，每50100m
7、g组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；p悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。 p培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)实验材料：人胚胎肾细胞293 http:/ 裂解。（注意：此时可放入-70长期保持）2.按0.2ml 氯仿/1ml Trizol加入氯仿(本实验加100l)，剧烈振荡混匀后室温放 置5min。 (注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上
8、进行。)3.4 12,000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层 为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的 60。4.吸取上层水相，至另一离心管中。一般400-450l 就足够了，宁少勿多！ （注：千万不要吸取中间界面） http:/ 6.4 12,000g离心10min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉 淀。7.按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。 8.4 12,000g离心5min，尽量弃上清。 9.室温晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min。
9、（注：RNA样品不要过于干燥 ，否则很难溶解。）10.加入10l无RNase的水，充分震荡混匀。http:/ 加500l Trizol用移液枪反复吹吸，直至 裂解液中无明显沉淀向裂解液中 加100 l氯仿4, 12000g 离心15min吸取上清液200250 l 至另一新离心管中 (切忌吸出白色中间层)向上清中加入等体积 异丙醇混匀4, 12000g 离心10min缓慢沿离心管壁 加入500l 75%乙醇4, 12000g 离心5min 小心尽量弃去乙醇加入10l RNase-free水 溶解沉淀备用室温静置5min盖紧离心管盖，用手振荡15s 室温静置5min上下颠倒离心管充分混匀 室温静
10、置10min小心弃去上清室温干燥沉淀2-5min（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）洗涤离心管壁轻轻上下颠倒http:/ 理：1.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2.而且物质对光的吸收是具有选择性的3.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度 有一定的比例关系.紫外光吸收法紫外光吸收法http:/ 40g/ml 的单链RNA。用双蒸水稀释RNA样品（1lRNA+49l水）倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA (mg/ml) = 40O
11、DRNA (mg/ml) = 40OD260260 读数读数稀释倍数稀释倍数(n)/1000(n)/1000dsDNA(双链DNA)1OD260 = 50ug/mlssDNA(单链DNA)1OD260 = 33ug/mlRNA1OD260 = 40ug/mlhttp:/ /OD280 2.0(1.82.0)，OD260 /OD230 2.0 p若OD260/OD280小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。p若OD260/OD280大于2.0，则提示可能有异硫氰酸残存或RNA降解。pOD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。紫外吸收检测紫外吸收检测RNARNA的纯度的纯度http:/
