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1、PCR法诊断非AIDS患者PCP的 临床对照研究牟向东北京大学第一医院呼吸内科研究背景n肺孢子菌肺炎（PCP）：伊氏肺孢子菌引起的严重肺部感染，常见于AIDS患者n近年来，非AIDS患者PCP的发病率明显升高n特点：起病急，进展快，误诊率高，病死率高n降低病死率的关键：早期诊断和早期治疗Am J Med Sci, 2001; 321(1): 56-65. 传统诊断方法n六胺银染色（GMS）：特异性 敏感性n姬姆萨染色（Giemsa Stain）：特异性敏感性n检测标本：痰液、诱导痰、BALF、肺组织n迄今为止，无肺孢子菌体外培养技术临床应用Utility of Gomori methenami
2、ne silver stains in bronchoalveolar lavage specimens. Mod Pathol, 1994; 7(5): 599-604.研究目的n临床迫切需要一种高效无创的诊断方法n敏感性 特异性nPCR法或许是一种理想的选择n评价PCR法对非AIDS患者PCP的诊断价值研究对象n分两组：均为非AIDS患者n试验组：PCP患者 20例n对照组：非PCP患者 40例n标本：痰液和BALF试验组（PCP组）入选标准n临床表现为发热和/或呼吸困难n胸片和/或胸部CT表现为双肺弥漫性病变nBALF肺孢子菌包囊镜检阳性（六胺银染）胸 片HRCT对照组（非PCP组）入选
3、标准n同期住院的、为明确诊断需行支气管肺泡灌洗检测的、非AIDS非PCP患者40例：n细菌性肺炎20例，特发性间质性肺炎10例n弥漫性肺泡出血3例，肺泡蛋白沉积症3例n曲霉菌肺炎2例，巨细胞病毒肺炎1例，肺结核1例n上述患者均经组织病理学或病原学确诊，并符合相应的治疗转归nBALF肺孢子菌包囊镜检阴性（六胺银染）试验方法n所有患者留取痰液及BALF标本n应用六胺银染色检测肺孢子菌包囊n应用普通PCR法检测肺孢子菌线粒体DNAPCR引物 n肺孢子菌线粒体大亚基rRNA中的两个片段n碱基序列分别为：n5-有义引物 pAZ102-E：n5- ATGGCTGTTTCCAAGCCCA-3n3-反义引物
4、pAZ102-H：n5- GTGTACGTTGCAAAGTACTC-3 模板制备 n取痰或BALF标本1 mln加等量1 mol/ L NaOH，37水浴30min ，6000 r/min 离心5min，用生理盐水洗2次n加10buffer、0. 5 % NP-40、5 %Tween-20 各30l，最后加无菌去离子水至300l ；n置60 水浴1 h；100煮沸15 min，6 000 r/ min离心1min后备用。 反应体系 n模板2. 5ln20mol/ L引物pAZ102-E及pAZ102-H各1. 5ln10 mmol/ LdNTPs 2. 0ln3U/l Taq酶1l；n10bu
5、ffer 5ln无菌去离子水11. 5l，混匀后加无菌石蜡油45l 反应条件 n 94预变性5 minn94 变性1 minn55 退火1. 5 minn72 延伸1. 5 minn35 个循环后n72 延伸7 min 电泳及对照 n 取10l扩增产物行琼脂糖凝胶电泳n阳性对照：标准品DNA n空白对照：不含模板DNA n内对照：PCR阴性标本标准品DNA 结 果六胺银染色BALF-GMS染色镜检组别阳性（n）阴性（n）试验组 （n）200对照组（n）040注：n为病例标本数。PCP诊断的金标准，试验分组的依据痰液GMS染色镜检组别阳性（n）阴性（n）试验组 （n=20）713对照组（n=40
6、）040注：n为病例标本数。痰液GMS染色镜检的敏感性为35%，特异性为100%300400PCR产物200阴性对照 阳性对照 内对照 痰 灌洗液 BALF肺孢子菌PCR检测组别阳性（n）阴性（n）PCP组（n=20）200非PCP组（n=20 ）040注：n为病例标本数。痰液肺孢子菌PCR检测组别阳性（n）阴性（n）PCP组（n=20）200非PCP组（n=20）040注：n为病例标本数。PCR 结果n试验组20例痰液PCR检测均阳性，敏感性为100%n对照组40例痰液PCR检测均阴性，特异性为100%n试验组20例BALF检测均为阳性，敏感性为100%n对照组40例BALF检测均为阴性，特
7、异性为100%讨 论nBALF六胺银染色镜检PC包囊- 金标准nPCP患者病情重，严重的呼吸衰竭n痰液GMS镜检PC包囊敏感性低（35%）nPCP患者干咳少痰， PC嗜肺泡上皮，存于FACn痰液PCR具有很高的敏感性和特异性（100%）n有研究表明，漱口液的敏感性就可达50-70%Foamy Alveolar Casts, FAC讨 论n特殊病原体n常见的病原微生物中的线粒体基因极少与其同源n机会性感染n幼儿感染不发病，成人潜伏觅无踪n普通PCR几乎无法检测到（nest-PCR除外）n环境中少，无污染nPC是营养缺陷型病原体，无法存活于游离的自然界S-腺苷甲硫氨酸结 论nPCR法对非AIDS患者PCP的诊断具有很高的价值n痰液PCR检测可作为一种高效无创的诊断方法n痰液PCR阳性+典型影像学可临床诊断PCPn本试验样本数较少，仍需进一步的研究证实
