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1、厌氧菌的分离与鉴定 卫生部北京医院陈东科近十年来已了解到，无芽胞厌氧杆菌及球菌是 细菌性感染中重要原因之一，大部分是混合 感染与兼性厌氧菌同时存在。 厌氧菌感染是一种内源性感染，病种遍及临床 各科、人体的各个部位。各种器官的感染均 可发生厌氧菌感染。 因此开展厌氧细菌检验对感染性疾病的诊断和 治疗有十分重要的临床价值。w 厌氧菌检验是临床微生物检验的重要组 成部分。在无氧（或少氧）条件下，或氧化还原电势 低的条件下才能繁殖的细菌称为厌氧菌。因 为厌氧菌在人体肠道、口腔、泌尿生殖道正 常菌群中占优势，所以当人体菌群失调时， 厌氧菌可能侵犯人体许多部位，发生严重的 甚至致死的内源性厌氧菌感染。厌氧
2、菌感染 常发生在深部伤口, 但也可伴兼性厌氧菌和需 氧菌侵犯人体任何器官和组织。所以，对厌 氧菌检验应给予高度重视。w 常规细菌室开展厌氧培养的重要性及可 行性 w 厌氧培养开展现状 w 厌氧培养的基本条件 w 厌氧培养中的关键问题 w 厌氧培养技术的进展人体各部位厌氧菌寄生量及其与需氧菌之比w_ w厌氧菌数量 眼结膜 鼻涕 唾液 牙表面 牙周袋与牙垢 _ w（cfug） 1034 1014 1089 10910 101112 w厌氧菌与 需氧菌之比 10:1 10:1 810:1 1:1 1000:1 _w厌氧菌数量 胃液 结肠 小肠 阴道 外尿道 皮肤 _ w （cfug） 1025 10
3、1112 1046 1089 1035 1034 厌氧菌与 需氧菌之比 1:1 1000:1 1:1 10:1 10:1 10:1 w_人体各部位厌氧正常菌群身体部位 相对数量已报道厌氧菌 皮肤少 丙酸杆菌属、革兰阳性厌氧球菌 上呼吸道+ 放线菌属、真杆菌属、丙酸杆菌属、类杆菌属 、 梭形杆菌属、革兰阳性及阴性厌氧球菌 口腔+类杆菌属、梭杆菌属、厌氧球菌、 革兰阳性无芽胞厌氧杆菌、放线菌属、 肠道+梭形芽胞杆菌、无芽胞G+杆菌、类杆菌、 梭形菌属、厌氧球菌 外生殖器+厌氧球菌、G-厌氧杆菌 (类杆菌) 阴道+类杆菌属、厌氧性球菌、双歧杆菌属、 乳酸杆菌属 尿道+类杆菌属、梭形杆菌属、厌氧球菌人
4、体各部位厌氧菌感染机率身体部位厌氧菌感染率% 单一厌氧菌感染菌血症10 154/5 中枢神经（脑脓肿）10 901/22/3 副鼻窦炎30 504/5 中耳炎561/10 化脓咽颊炎504/5 颈部感染1000 口腔感染1004/10 咬伤501/3 胸部感染60100 1/21/3 腹部感染1001/6 胆道感染40少 肝脓疡501/3 妇科感染70901/4 皮肤软组织感染60100 1/4最佳条件下各类厌氧菌分离比率厌氧菌分离率%最多见革兰阴性杆菌40类杆菌 革兰阳性厌氧球菌24消化球菌 革兰阴性厌氧球菌 3韦荣氏球菌 无芽胞革兰阳性杆菌20真杆菌菌属、 丙酸杆菌 梭形芽胞杆菌10不定常
5、规实验室开展厌氧菌培养的可行性w 临床医生逐渐认识到厌氧菌在感染性疾病中的重要地位，努力 配合，认真采样和送检。 w 可商品购到便宜简单可靠的厌氧培养系统，如厌氧盒6001000 元即可。各个大小细菌室均可分离到厌氧菌。 w 可靠的厌氧菌鉴定系统如API、Vitek及其他自动化仪器的厌氧菌 系统已经成功地应用到实验室。 w 自动化血培养系统均有厌氧培养并使血液厌氧菌培养成为常规 检查已成为现实。 w NCCLS已推荐出可作为厌氧菌药敏试验的方法。Etest法、琼脂 稀释法等。厌氧菌培养开展现状（108实验室 ）现状所占百分率% 未开展厌氧菌培养 77 未作为常规项目10 不规范开展 8 规范开
6、展厌氧菌培养 5厌氧菌培养的基本条件及设备设备 北京医院细菌室采用方式 生产厂商床边采样设备 厌氧袋试验合，内含气体发生器及指示剂共20套(45534) 法国生物梅里埃 输送培养基 Amies输送琼脂(41998、41999)难辩梭菌琼脂(43213) 法国生物梅里埃 常规准备培养基 厌氧血琼脂或斯氏琼脂+5%羊血(43273)斯氏万古霉素+5%羊血(43223) 自制或法国生物梅里埃 厌氧气袋 厌氧气体发生器10个/盒(96121) 法国生物梅里埃 厌氧盒或厌氧罐 510个厌氧盒(96127)： 法国生物梅里埃 厌氧罐： 英国OXOID公司法国生物梅里埃操作员应明确的几个问题w 常见厌氧菌的
7、分类学 w 操作者明确厌氧细菌在人体各部位的正常 菌群 w 各部位感染时可能分离出的厌氧菌种类 w 自己做的试验是否成功 w 指导临床正确采样和输送，最好亲自床边 采样可疑厌氧菌感染特征w 感染局部产生气体 w 分泌物有恶臭 w 分泌物带血或呈黑色 w 粘膜周围的感染，如肛周、口腔、鼻窦、咽 颊等 w 细菌培养阴性，但有菌血症表现 w 长期使用氨基糖苷类抗生素，但无效者 w 有基础疾病免疫低下者1.正确地选择标本w 下列细菌学指征有助于选择标本做厌氧培养 ： （1）深部伤口或软组织脓肿的脓，特别是伴 有恶臭或含有硫磺颗粒时。 （2）可疑为气性坏疽或少见的严重产气或坏 死性感染所取得的坏死组织或
8、病灶清除材料 。 （3）粘膜部位的感染灶取得的材料。 （4）从脑、肺、肝或其他器官的脓肿或从腹 腔内、肛周、隔下或其他部位的脓肿取得的 材料。w （5）无菌区感染灶的吸出液(包括血液 、脑脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水 等)。 （6）人或动物咬伤感染灶取得的材料 。 （7）变黑的或置于紫外线发红色荧光 的渗出物。 （8）革兰染色，镜下见到具有厌氧菌 独特形态的材料。 （9）可疑引起肉毒杆菌食物中毒的食 物。2.正确地收集标本w厌氧菌是人体许多部位（如皮肤、 口咽部、肠道和泌尿生殖道）正常 菌群中的一部分，因此下列材料无 需做厌氧培养： （1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。 （2）咳出的痰，通过支气管
9、镜取的分 泌物，排出或导出的尿、粪及胃内容物 。w 为排除或尽量减少正常菌群中厌氧菌的 污染，用注射器抽取标本比用拭子更好 ，特别适用于下列临床情况： （1）从未开放的脓肿抽取脓液。 （2）通过胸腔穿刺抽出的胸腔液。 （3）从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出或从肾 造口管收集的尿。 （4）气管切开吸取的肺分泌物。（5）女性生殖器：后穹隆穿刺。w （5）穿刺抽出的腹腔液。 （6）通过腰椎穿刺抽出的脑脊液。 （7）窦道标本可插入小导管用注射器 吸出，注射器和针头内的气体应全部排 出，将其内容物直接注入一个已排出气 的无菌试管内。也可自窦道损伤部位取 材做活组织检查。如果必须使用拭子， 应尽快接种于适宜的
10、培养基中。3. 正确地运送标本w 临床标本一旦离开人体部位，在进入厌 氧环境前，必须防止大气中氧的毒性作 用。应及时将取材的拭子、塑料导管内 的少量液体、吸入注射器的标本装入厌 氧生物袋或管，在运送过程中要保持厌 氧状态。培养基内不应含有肝素，因它 会抑制细菌生长。4. 使用新配制的培养基w 初代接种厌氧菌最好使用新配制的培养 基。 平板培养基无需在厌氧条件下贮存 ，用前可进行预还原，但厌氧条件下贮 存可延长培养基的有效期。必备厌氧培养用培养基w斯氏琼脂+5%羊血：适用所有厌氧菌 生长 w斯氏万古霉素+5%羊血：适用革兰阴 性厌氧菌的分离 w难辩梭菌选择培养基：分离难辩梭菌几种重要的厌氧选择培
11、养基w 卡那霉素、万古霉素溶血平板 (KVB)： 类杆菌属，特别是脆弱类杆菌和产黑色 素拟杆菌、 w 卡那霉素胆盐七叶苷平皿 (BBE)：脆弱 类杆菌 w 环丝氨酸、先锋克西叮、果糖、蛋黄平 皿(CCFA)：难辩梭菌5. 提供可靠的厌氧环境w 使用厌氧罐法、厌氧袋法或厌氧箱法。 在厌氧培养中必须使用氧化还原指示剂 ，一般采用亚甲基美兰或刃天青，每次 要新鲜配制。如果能在孵育的整个过程 中维持厌氧条件，指示剂溶液将无色， 否则指示剂则变色。厌氧培养装置w 厌氧手套箱：价格昂贵、操作时间长、气体 消耗大、不易推广 w 厌氧盒+厌氧气袋：应用最普遍、简便 或厌氧罐+厌氧气袋：方便实用w 厌氧罐抽气换
12、气法：需配置抽气换气装置 w 第二代厌氧气体发生剂不需加水、不需触酶6. 标本接种与孵育（1）拭子和液体标本直接接种固体和液体培养基（需 氧和厌氧培养各一份），在厌氧平板上贴一片灭滴灵 纸片（5g/片），置35培养。同时做直接涂片革兰 染色镜检。用铂-铱合金环（不用镍-铬合金环，因为 它可氧化接种物）三区划线接种平板，以保证长出单 个菌落。 w （2）若被检标本是组织块，则立刻将其移入无菌的 组织研磨器内，用硫乙醇酸盐混合研碎，最好在厌氧 箱内或无氧条件下操作。组织匀浆接种同液体标本。 w （3）可疑含有芽胞梭菌的标本，还要用乙醇或加热 处理后再行接种。简单步骤 (适用无条件作鉴定单位)床边采样或输送培养基涂片记录 厌氧血琼脂 需氧培养染色不匀 平皿 羊血琼脂典型厌氧菌 48h35厌氧培养 中国蓝琼脂形态可作一 初步报告 可疑菌落作耐氧试验 24h 35需 O2 厌氧血碟 需氧血碟 涂片 鉴定48h厌氧培养 24h需氧培养 生长 不生长 不生长 生长继续做第二次 非厌氧菌 可疑厌氧菌与厌氧 非厌氧菌耐氧试验 培养对照决定 厌氧生长 需氧不生长涂片报告厌氧菌分离鉴定流程临 床 标 本血琼脂 厌氧血琼脂或 涂片革兰染色中国蓝琼脂 选择培养基 记录结果 需氧培养基18-24h 48h厌氧培养 需氧菌鉴定报告 可
