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1、质粒DNA的提取鉴定n掌握碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA原理和方法。n掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。一、实验目的质粒（plasmid）是一种独立的稳定的遗传因 子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的 DNA分子，大小从1kb到200kb不等，具有自主复 制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 并表达所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要 利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没 有质粒时是可以正常生长的。因此，质粒是一种寄 生性的自主复制子。细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是 分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达 的好材料。二、实验原理l碱变性抽提法
2、法是常用的方法之一.l此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达 到分离的目的。l在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺 旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋 共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8 的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA又 恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色 体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分 子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。二、实验原理抽提中各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在：1. 共价闭环DNA（covalently closed circular DNA
3、， cccDNA），常以超螺旋形式存在；2. 开环DNA（open circular DNA，ocDNA），此种质 粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形 成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的 环状分子； 3. 线状DNA（linear DNA，lDNA），质粒DNA的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形 和超螺旋DNA。cccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。 三、操作步骤详见189-190页50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2200 mM NaOH 1%
4、（W/V） SDS3 mM KAC 2510 min30 min 以上l 不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。l 核酸构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。同一质粒DNA的泳动速度次序为：共价闭环DNA开环DNA线状DNA。l溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在波长254nm紫外光照 射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧 光指示剂指示DNA含量和位置。四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理1.琼脂糖凝胶的制备：本实验采用1.0%的琼脂糖凝胶。称 取0.3g琼脂糖放入锥形瓶，加入30ml电泳缓冲液，置于微波炉 使
5、其充分融化。室温放置至60左右，加入EB使其终浓度为 0.5ug/ml，混匀，倒胶板（30ml/板）。2.凝胶板的制作： 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两 端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的模 板置于水平台上，迅速将上面 胶液倒在模板的中央，让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固，将胶纸围墙慢慢取下，制备 好的凝胶板放入电泳槽中，加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深， 取出样品梳。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤3. 加样：20ul TE + 3ul 上样缓冲液 ，取6ul 进行点样 4. 电泳：l电压：60Vl电泳时间：0.5 hl电泳终止：指示剂距离凝胶前 沿约1cm处 5.检测：取出胶板，用紫外检测仪 观察结果。纯的质粒DNA只有超螺 旋DNA一条带。 6.凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在 指定的地方，待干燥后烧毁，不能 倒在垃圾中，以防EB污染。五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤六、实验报告要求一、 原理 二、 操作 三、 结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名 称、强弱、距离） 四、 结果说明 五、 思考题 1、分离提取DNA的过过程中哪些因素会引起链链的断裂 ? 2、本实验为了质粒DNA纯度和分子的完整性，采用 了哪些措施？
