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1、第八章 位点特异性重组与DNA的转座 1. 保守性位点特异性重组 2. 位点特异性重组的生物学作用 3. 转座 4. 转座子及其调控本章内容重组的两种形式重组的两种形式一、保守性位点特异性重组（CSSR）1. 位点特异性重组发生在目标DNA上的特异序列中。 噬菌体基因组嵌入噬菌体基因组嵌入 宿主染色体中。宿主染色体中。3 3种种CSSRCSSR重组方式。重组方式。参与保守性位点特异性重组的结构。参与保守性位点特异性重组的结构。位点特异性重组的分子机制：位点特异性重组的分子机制：attPattP和和attBattB交错切割发生重组。交错切割发生重组。噬菌体的attP 为P.O.P ,细菌的att
2、B为 B.O.B O 为 attP 和attB相同的核心序列，长15bp，重组发生在此序列中。attP 235 bp attB 23 bp P-O-P B-O-B -152 0 +82 -11 0 +11 G C T T T T T T A T A C T A A C G A A A A A A T A T G A T T 2. 位点特异性重组酶利用共价蛋白-DNA中间体切割 分离与连接DNA。 -位点特异性重组酶有两个家族：丝氨酸重组酶与酪氨酸 重组酶。丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶使用的共价蛋白丝氨酸重组酶与酪氨酸重组酶使用的共价蛋白-DNA-DNA中间体。中间体。重组酶的家族与功能重组酶的家
3、族与功能丝氨酸重组酶催化的重组。丝氨酸重组酶催化的重组。二、位点特异性重组的生物学作用细胞与病毒用位点特异性重组可实现各种各样的生物学功能。-噬菌体利用重组机制在感染时将本身DNA嵌入到宿主染色体中。-位点特异性重组可用于改变基因表达。-位点特异性重组还广泛用于DNA复制、同源重组和细胞分裂周期中保持环状DNA分子的结构完整。1. 1. 嵌合嵌合酶酶可促可促进进进进病毒基因病毒基因组组组组与宿主与宿主细细细细胞胞 染色体的嵌合和分离。染色体的嵌合和分离。2. 2. 噬菌体噬菌体 的分离需要一种新的的分离需要一种新的DNADNA弯曲蛋白。弯曲蛋白。重组位点。重组位点。IHFIHF弯曲弯曲DNAD
4、NA进入进入DNADNA结合位点模型。结合位点模型。3. 3. HinHin重组酶反转重组酶反转DNADNA片段使其他基因表达。片段使其他基因表达。沙门氏菌感染人类细胞的电镜图沙门氏菌感染人类细胞的电镜图 沙门氏菌重组催化DNA反转4. 4. HinHin重组需要一个重组需要一个DNADNA增强子。增强子。 5. 5. 重组酶将环状多聚重组酶将环状多聚DNADNA分子转化为单体。分子转化为单体。 6. 6. 其他机制。其他机制。转座因子的发现 B. McClintock的玉米遗传研究1951年，B.McClintock根据长期对玉米的遗传研究， 提出了转座（transposition）的概念，
5、提出基因可以移动的 新观点。 Shapiro的E.coli半乳糖操纵子研究 半乳糖操纵子galK基因编码半乳糖激酶；galT基因编码半乳糖尿苷酰转移酶；galE基因编码半乳糖异构酶。 三、转座半乳糖操纵子半乳糖操纵子1. 1. 一些遗传元件通过转座（一些遗传元件通过转座（transpositiontransposition）转到）转到 新的染色体位置上。新的染色体位置上。2. 2. 有有3 3种类型的转座因子。种类型的转座因子。 -DNA-DNA转座子转座子 - -类病毒反转座子类病毒反转座子 -poly-A-poly-A反转座子反转座子基因组中的转座子：出现位置与分布基因组中的转座子：出现位
6、置与分布原核生物转座因子 类型（1）插入序列（insertion sequence ,IS） E.coli K12中有IS1, IS2, IS3, IS4, IS5。E.coli的F因子中有IS2, IS3(4个),，。 末端的序列相同或相近，但方向相反，称为反向重复 序列（IR），与其相连的宿主DNA末端会产生正向重 复序列（DR）。 仅编码与转座有关的转座酶，转座酶交错切割宿主 DNA，然后IS插入，IS两端形成DR。ISIS的结构与功能的结构与功能部分IS的结构IS种类类长长度（bp ）IR （bp ）ID （bp ）靶的选择选择拷贝贝数IS1768239随机5-8IS21327415热
7、热点5IS414281811/12AAAN20TTT1-2IS51195164热热点不详详IS10R1329229NGCTNAGCN不详详IS9031057189随机不详详靶重复的形成靶重复的形成（2）复合转座子（composite transposon） 两端由IS元件组成，元件相同或不相同，方向相同 或不相同；两端元件都有功能或仅一侧元件有功能。 中心区域编码抗性标记，不同复合转座子的抗性标 记不同，例如Kanr 、Camr 、Strr 、Bler 等。 两个IS元件能够使它们之间的DNA序列转座。复合转座子的结构复合转座子的结构真核生物 转座因子玉米的转座因子 （1） McClintoc
8、k的发现玉米的红色花青素合成受多基因控制，使胚乳呈 紫色。其中任一基因突变都使色素合成受阻，胚乳变白 。如果发生回复突变，会导致斑点产生。McClintock发 现，色素基因C突变是由“可移动的控制因子”引起的， 称为解离因子（dissociator ,Ds），它可插入C基因中 。另一可移动的控制因子是激活因子（activator,Ac） ，Ac能激活Ds转入C基因，也能使Ds从C中转出，这就是 Ac-Ds系统。玉米色斑的形成玉米色斑的形成（2）玉米的控制因子家族McClintock还发现了Spm-Dspm系统。每个家族都 有自主性因子和非自主性因子。 自主性因子有切离和转座能力。可插入任何位
9、点 产生不稳定的或可“突变”（mutable）等位基因。自 主性因子的丢失，可使可变的等位基因变成稳定的等 位基因。 非自主性因子是稳定的，自身不能转座，来源于 失去反式作用功能的自主因子，而这种功能是转座所 必须的。 控制因子家族是通过这两种因子相互作用来划定 的。一个家族由单个类型的自主因子组成，这些因子 由很多种非自主因子相伴随。 玉米Ac-Ds系统的结构Ac序列由含5个内含子的单个基因编码，其产物为转座酶 ，末端有11bp的IR和8bp的DR。Ds是由Ac缺失产生的，Ds9缺失194bp；Ds6只保留2Kb。 转座酶失活但保留完整的转座酶作用位点（包括末端）。 Ac-Ds属于非复制型转
10、座，发生转座后，它们从供体位置 上消失。果蝇的P因子 （1）果蝇的“杂种不育”品系某些果蝇品系杂种后代现一系列缺陷，在P-M系统的杂 交中，子一代具有正常的体细胞组织，但性腺不能发育。P() P() F1 正常能育M() M() F1 正常能育M() P() F1 正常能育P() M() F1 不育（2）P 因子研究发现，杂种不育是由于在W位点插入P因子（P element）所致，P品系有P因子，M品系无P因子。P因子长2.9 Kb ，有4个开放阅读框(ORF)，末端有 31bp反向重复序列，靶DNA产生8bp的正向重复序列。一个P品系果蝇带有30-50拷贝的P因子，其中1/3具完 整结构，不
11、完整的P因子是由于缺失而产生的，丧失转座 能力。P因子的激活有组织特异性，它仅发生在生殖细胞中。 但P因子在体细胞和生殖细胞中都转录。组织特异性表现 在不同的细胞中转录的方式不同（剪接方式不同）。（3） P因子的组织特异性表达 P因子有3个内含子，4个开放阅读框（ORF0-ORF3） 初始转录本有2.5Kb和3.0Kb两种长度的RNA 不同组织中产生不同的蛋白质：在体细胞中，剪切内含子1和内含子2，保留内含子3；产生ORF0- ORF1-ORF2编码区，翻译成66KDa蛋白，是一种转座的阻遏物。在生殖细胞中，剪去3个内含子，产生4个阅读框的编码区，翻译 成87Kda蛋白，是一种转座酶。P基因的
12、结构及其表达产物（4） P() M() 杂种不育的解释杂种不育主要原因是内含子3的组织特异性剪接。 P ()P () 66KDa蛋白阻止P元件转座M ()P () 66KDa蛋白阻止P元件转座P ()M () 父本P产生87Kda蛋白（转座酶）， 导致后代不育。果蝇不同杂交组合果蝇不同杂交组合 P P产物对育性的影响产物对育性的影响3. 转座的类型 复制型转座： 转座元件被复制，转座的序列是原元件的 拷贝。转座子复制后一个拷贝保留在原位，一个拷贝转 移到另一位置。 非复制型转座：转座元件从一个位置转移到另一位置。 保守型转座：另一类非复制型转座。转座因子从供体位 点上切离，插入靶位点上，供体上
13、转座子两侧的DNA双 链被保留。复制型转座的基本过程复制型转座要产生一个共合体，其原理是：游离的3端以已连接的转座子为模板进行复制、连接，使转座子产 生重复，形成共合体。共合体的形成共合体的形成MuMu噬菌体转座产生共合体噬菌体转座产生共合体非复制型转座的基本原理转座子插入靶DNA，两侧为靶DNA正向重复序列，供体部位留下 缺口。模式1 转座因子和受体分子形成形成交叉结构，受体分子的 单链切口与转座因子单链游离末端连接，并在插入位点上产生正向 重付序列，通过交换使转座因子转座到受体分子。模式2 供体分子上转座因子两端产生双链断裂，使转座因子 释放出来，然后在受体分子产生的交错接口处插曲。非复制
14、型转座模式非复制型转座模式1 1非复制型转座模式非复制型转座模式2 24. 反转录病毒和反转座子转座子是基因组中独立的可移动的DNA序列。从DNA 到DNA的转移称为转座。从DNA到RNA再到DNA的转移 称为反转座。反转座是由RNA介导的转座过程。以RNA为中间体的转座为真核生物所特有。反转录病 毒能将其RNA基因组的DNA拷贝以原病毒的形式整合到宿 主基因组中。一些真核生物转座子的结构与原病毒的结构 有关，并且通过RNA中间体进行转座，这一结构单位称为 反转录转座子(retrotransposons) 或反转录子(retroposons) 。（1）反转录病毒及其生活周期 反转录病毒具有单链
15、 RNA基因组 每个病毒颗粒包装有两个RNA基因组，因此，单一病毒 颗粒实际上是二倍体。 反转录病毒生活周期反转录病毒（正链病毒）感染细菌病毒RNA反转录 DNA（负链DNA）催化合成第二条DNA链（正链DNA） 整合到宿主DNA中成为原病毒转录生成病毒基因组 RNA(转录出病毒mRNA、翻译成病毒蛋白质或者作为子代病 毒基因组）反转录病毒生活周期反转录病毒生活周期（2）反转录病毒基因组结构与功能 含有3-4个基因，实为编码区，每各编码区通过加工产 生多种蛋白（多聚蛋白），经酶切成为单一的蛋白质形 式。反转录病毒mRNA通常结构，5 端加帽，3端与polyA 相连。全长的mRNA被翻译时，产物为gag和pol 蛋白。翻译从 第一个起始密码子开始而终止于第一个终止密码子，产 物为gag蛋白。表达pol 蛋白必需越过终止密码子，效率 为5%，因此，gag蛋白是gag-pol蛋白的20倍。经剪切产生一个短的亚基因组 (subgenomic) 的 mRNA ，其表达产物为env。反转录病毒反转录病毒“ “基因基因” ”的表达的表达（3）反转录病毒的结构形式 病毒基因组RNA结构两个末端有正向重复序列R (10-80bp) ，5 端R之后是 U5 (80- 100bp) ；3端R内侧是U3 (170-1260bp)。病毒线形双链DNA结构5 端加U3，3端加U5
