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1、实验项目实验项目：动物细胞融合动物细胞融合细胞核的分离和鉴定细胞核的分离和鉴定 班班 级级：20122012级级L-4L-4 小组成员：小组成员：实验一：动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动受精作用两个细胞正在融合动物细胞融合基本过程：诱导方法：诱导方式物理法：化学法：生物法： 灭活的病毒电刺激聚乙二醇PEG聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚 和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原 生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物 细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝 集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就 会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机 理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，
2、 使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高 ，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不 适用。聚乙二醇PEG诱导融合一、实验目的 1、了解动物细胞的融合 2、熟悉PEG诱导细胞融合的方法 3、掌握动物细胞融合的基本原理及方法二、实验原理细胞融合（cell fusion）：由两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为细胞自发融合和诱导细胞融合。诱导细胞融合（ induced cell fusion） ：指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象。 1、材料：HeLa细胞、CHO细胞、鸡红细胞 。 2、试剂：聚乙二醇（PEG，MV=40
3、00） Hanks液、0.25%胰蛋白酶、RPNI1640培养 液（含10%灭活小牛血清和不含血清的两 种）、PBS、0.2%次甲基蓝染液。 3、仪器设备：显微镜、水浴箱、普通离 心机、高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯 、试管。三、实验试剂及材料实验选材：本次试验选用鸡的外周血做细胞融合材 料, 这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴 别； 2. 实验材料便宜、易得，避免了用培养的细胞株 做细胞融合实验材料所耗的实验成本和精力；3.细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来 进行鉴别。若细胞内只有一个核，定为未融合细 胞；有二至多个核，定为融合细胞。四、实验步骤： 1、取肝素抗
4、凝的弃血清鸡血0.1ml(本实验是进行同种 细胞融合）。 2、将悬液移入离心管中，以800r/min离心78min，倾 去上清液，加入810ml Hanks液，再次悬浮细胞，离 心洗涤一次，倾去上清液后将离心管倒置与滤纸上，尽 量流尽剩余液体（这一步骤很重要，因为残留液体会改 变PEG的浓度）。 3、用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取 制备好的50%PEG0.4ml，在37水浴中，于90s内逐滴加 入离心管中，边加边振摇离心管，使之与细胞混匀，然 后加入810ml Hanks 液，轻轻吸打混匀，在37水浴 中静置5min 以稀释PEG。离心弃去上清液后，加入2 3ml含小牛血清的16
5、40培养液，在37水浴中孵育30min 。加入810ml Hanks常规方法消化制细胞悬液将悬液移入将悬液移入离心管中800r/min离心78min倾去上清液再次悬浮细胞离心洗涤一次手指轻弹离心管在37水浴中于90s内逐滴入 离心管加入7-8ml Hanks在37水浴中静置 5min稀释PEG 齐去上清液在37水浴中 卵育3min加2-3ml含小牛的1640培养液在5min 10min 20min 30min去悬液制片用0.2%次甲基蓝染色观察一瓶已长成Hela细胞 或CHO细胞倾去上清 液， 将离心管 倒置于滤 纸上吸取50%PEG0.4ml五、预期结果： （一）融合过程观察： 分别于温育5
6、min、10min、15min、 20min、30min取细胞悬液一滴制成临时 装片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微 镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把 融合过程大致分为5个阶段：五个阶段 两个细胞的膜相互接触，粘连。 相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道 。 两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道 。 通道扩大，两细胞连成一体。 细胞合并完成，形成一个含有两个或多个 核的圆形细胞。 （注：上述阶段可在不同时期观察）细胞融合过程图六、注意事项： 1、制备的50%PEG一定要保存于37水浴 中，不然冷却后结晶析出。 2、在理想管中加PEG之前，一定要将离心 管倒置于滤纸上，流尽剩余液体，否则
7、残 留液会改变PEG的浓度。 3.操作规范，防止试剂污染。 4.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 5.使用离心机要注意平衡，转速从低到高 。一、实验目的1 掌握分离细胞核的原理 2 熟悉细胞核的鉴定方法 3 了解细胞核的分离过程 4 掌握离心机的正确使用方法实验二：细胞核的分离和鉴定二、实验原理 细胞核的结构是由核膜、染色质、核仁和 核基质构成,细胞核的比重和大小与细胞内 其他组分不同，在同一离心场内其沉降速 度也不同，所以常用不同介质的离心力离 心(差数离心），将细胞各细胞器和组分 分级分离出来。再运用细胞化学法进行鉴 定.三、试验器材及试剂 器材：光学显微镜、离心机、离心管、天 平、镊子 、载玻
8、片、盖玻片、染色盘架、纱布、解剖剪、玻璃漏 斗、25ml烧杯、量筒、滴管、玻璃匀浆器 试剂：1%甲烯兰染液 生理盐水 缓冲液：0.25ml蔗糖 3mmolMgCl2 0.5 TritonX- 100 0.5 TritonX-100 10mmol Tris-HCl pH=7.9 缓冲液：1mol蔗糖 3mmolMgCl2 1 TritonX-100 材料：家兔肝细胞四、实验步骤：1、 断脊柱法处死家兔，迅速开腹取肝，在盛有生理 盐水的小烧杯中反复洗涤。2、称取湿重约1g的肝组织，量取8ml预冷的匀浆缓冲 液（0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液）并加 入烧杯中，尽量剪碎肝组织。
9、3、匀浆彻底后，样品夜4层纱布过滤（先用少量匀浆 缓冲液润湿纱布）后静置5min,弃去沉渣，滤液转 移至玻璃离心管中。4、平衡离心管，离心10min(1000r/min)后,将上清液 经8层纱布过滤。再用足量的缓冲液悬浮沉淀。6、取以上得到的溶液制一张涂片，自然干燥。用1 甲烯兰染液对涂片进行染色。5、在另一只离心管中先加入1/3体积的缓冲液，在家以 上悬浮液加入管内缓冲液上（不要混匀），然后将其以离 心10min(1000r/min)。7、冲去染液，晾干。8、镜下观察。五、预期结果 低倍镜下找到标本，在换到高倍镜，可见 红细胞的细胞核已经游离出来，圆形，被 染成蓝紫色，中央有2-4个甚至更多个深 蓝色核仁。六、注意事项1、离心机的正确使用2、涂片技巧3、保持试验台的卫生
