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1、 溶氧溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为限制因素。因素。 在在28氧在发酵液中的氧在发酵液中的100的空气饱和浓度只有的空气饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右，比糖的溶解度小左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内几秒（分）钟之内便便耗竭，使溶氧成为限制因素。耗竭，使溶氧成为限制因素
2、。 第六章 氧的供需及对发酵的影响q 微生物对氧的需求q 发酵液中氧的供给q 影响Kla的因素（供氧的调节）q 与溶氧相关的参数测定q 发酵过程中溶氧监控的意义q 厌氧发酵的基本知识第一节 微生物对氧的需求一、描述微生物需氧的物理量一、描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸强度（比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌菌-1h-1 摄氧率摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1 。r= QO2 .X二、溶解氧浓度对菌体生长和
3、产物形成的影响二、溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响CCrQO2CLCCr: 临界溶氧浓度临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。微微生物生物温温度度/C C临临界界/(mmol/L)/(mmol/L)相相对对于饱和于饱和浓度浓度（%）大大肠肠杆菌杆菌37.837.80.00820.00823.283.28酵酵母母菌菌34.834.80.00460.00461.841.84米米曲曲霉霉30300.020.028 8青青酶酶菌菌30300.0090.0093.63.6粘粘性性赛赛氏氏杆菌杆菌31310.0150.0156 6某些微生物的临界溶氧溶度一般
4、对于微生物： CCr: 115%饱和浓度定义：氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1.问题：问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中 氧很容易满足。氧很容易满足。生物类型 呼吸强度（氧气，鲜重） l g-1 h-1 仙人掌 3.00 蚕豆 96.60 小麦 251.00 细菌 10 000.00 (0.01/22.4)36=0.016 g g-1 h-1微生物的呼吸强度与溶氧溶度例：以菌浓例：以菌浓X为：为：10 g/L 计计 微生物的摄氧率微生物的摄氧率0.3 g O2L-1h-1 计，
5、计， (0.25/1000)36/0.3=0.03 h=108 s注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样： 头孢菌素头孢菌素 卷须霉素卷须霉素生长生长 5% (相对于饱和浓度）相对于饱和浓度） 13%产物产物 13% 8%品种品种测定水温测定水温窒息点窒息点（mmol/lmmol/l) )相当于相当于鲤鱼鲤鱼29290.09-0.09-0.010.014%4%鲢鱼鲢鱼27270.01-0.01-0.020.024-8%4-8%鲫鱼鲫鱼29290.0040.0042%2%氧对鱼类的影响胡隐昌，水产养殖,2003三、影响需氧的因素三
6、、影响需氧的因素r= QO2 .Xq 菌体浓度菌体浓度q QO2 遗传因素遗传因素 菌菌龄龄 营养的成分与浓度营养的成分与浓度 有害物质的积累有害物质的积累 培养条件培养条件第二节 反应器中氧的传递一、发酵液中氧的传递方程一、发酵液中氧的传递方程CCiPPi气膜气膜液膜液膜N：传氧速率：传氧速率 kmol/m2.hkg: 气膜传质系数气膜传质系数 kmol/m2.h.atmKl: 液膜传质系数液膜传质系数 m/hC*P/H, 与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度 H:亨利系数亨利系数Kl: 以氧浓度为推动力的总传递系数以氧浓度为推动力的总传递系数 (m/h)
7、再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m2/m3)Nv：体积传氧速率：体积传氧速率 kmol/m3.hKla: 以以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数为推动力的体积溶氧系数 h-1二、发酵液中氧的平衡二、发酵液中氧的平衡发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中传递传递(OTR)：消耗消耗(OUR)：r= QO2 .X氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度(DO)上面上面徐庆阳等 微生物学通报，2007谷 氨 酸 发 酵 产酸 转化率标准(40-50) 122.0
8、63.7%低 (20左右） 115.2 57.0% 徐凯等，中国调味品，2007郜培等，食品工业发酵，2005郜培等，食品工业发酵，2005三、供氧的调节三、供氧的调节C有一定的工艺要求，所以可以通过有一定的工艺要求，所以可以通过Kla 和和C*来调节来调节其中其中C*P/HNvHPKla调节Kla是最常用的方法，kla反映了设备的供氧能力。 45升升 1吨吨 10吨吨搅拌速度搅拌速度 250 rpm 120 120供氧速率供氧速率 7.6 10.7 20.1不同的设备供氧能力不一样不同的设备供氧能力不一样第三节 影响Kla的因素 Kla反映了设备的供氧能力 发酵常用的设备为：摇瓶 发酵罐 一
9、、影响摇瓶kla的因素为装液量和摇瓶机的种类为装液量和摇瓶机的种类摇瓶机摇瓶机往复，频率往复，频率80-120分分/次，振幅次，振幅8cm旋转，偏心距旋转，偏心距25、12,转述转述250rpm250,500,1000,2000ml 装液量，一般取装液量，一般取1/10左右：左右： 250ml 15-25 ml 500ml 30 ml 750ml 80 ml例：例： 500 ml 摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响 装液量装液量 30 ml 60ml 90ml 120ml 酶活力酶活力 713 734 253 92二、影响发酵罐中二、影响发酵罐中K
10、la的因素的因素通风搅拌发酵罐已知在通风搅拌发酵罐中，全挡板条件下：已知在通风搅拌发酵罐中，全挡板条件下：1、理论上分析、理论上分析KLand通气量提高搅拌，调节提高搅拌，调节kla的效果显著的效果显著例例 某一产品的发酵某一产品的发酵 d n p0/v c 产量产量 450 180 1.62 20% 4978 450 280 2.12 40% 5564 550 180 2.61 60% 8455例例 黑曲霉生产糖化酶黑曲霉生产糖化酶 n 230 230 270 通气量（通气量（VVM) 0.8 1.2 0.8 产量产量 1812 2416 2846提高提高d、n显著提高显著提高C,提高了产量
11、提高了产量提高提高N, 比提高比提高Q有效有效2、实际上：、实际上：对于转速的调节有时是有限度的对于转速的调节有时是有限度的通风的增加也是有限的通风的增加也是有限的蒸发量大蒸发量大中间挥发性代谢产物带走中间挥发性代谢产物带走例：红曲霉生产色素用于食品工业，静止培养改为通气培例：红曲霉生产色素用于食品工业，静止培养改为通气培 养，比色法测定产量：养，比色法测定产量：通气通气 静止静止 1.4 2.0 3.1 6.8 19.5 OD 0.28 0.7 8.3 15.6 14.3 6.2提高提高下降下降所以这些因素的存在，发酵设备的供氧是有限的所以这些因素的存在，发酵设备的供氧是有限的3、小型发酵罐
12、和大型发酵罐调节、小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点的特点q 小型发酵罐，转速可调小型发酵罐，转速可调q 大型发酵罐，转速往往不可调大型发酵罐，转速往往不可调 大型反应器的合理设计大型反应器的合理设计 对现有设备一定要注意工艺配套对现有设备一定要注意工艺配套4、生物反应器放大的基本思想小型反应器和大型反应器的差异： 传动 传热 传递生物反应过程剪切、混合、供氧箭叶平叶不同搅拌浆对菌体浓度的影响发酵过程中搅拌转速和溶氧的变化平叶箭叶箭叶：在4h左右溶氧就从90的下降到14.8%，通过不 断提高转数DO水平始终维持在20%左右。平叶：在8h左右才下降到23.43%; 中后期DO水平则 一直在4
13、0%以上。平叶箭叶庆大霉素的生产水平提高了40%以上Ooterhuis, N. M. G., et al. Biotechnol. Bioeng, 1983Enfors, S. O. et al, J. Biotechnol, 2001叶勤，发酵过程原理，叶勤，发酵过程原理，2005叶勤，发酵过程原理，叶勤，发酵过程原理，2005rpm=600rpm=600Junker, B. H., et al. Bioproc. Eng., 1998CD-6及HE-3搅拌器应用需注意的问题：1） CD-6下层搅拌对防止气泛起决定作用；2） HE-3上层搅拌对防止气泛，增强发酵液的湍流状态起决定性作用刘振宇
14、，发酵工程（技术与实践），刘振宇，发酵工程（技术与实践），2007华北制药集团的刘振宇高级工程师华北制药集团的刘振宇高级工程师 注：注：CD-6,CD-6,圆盘六平叶圆盘六平叶 HE-3, HE-3,三叶螺旋浆三叶螺旋浆计算流体力学计算流体力学发酵过程放大困难的原因就在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败(供氧、混合、剪切）。叶勤，发酵过程原理，叶勤，发酵过程原理，2005q 根据r,Kla、搅拌桨特性搅拌功率q 根据r、菌体细胞剪切搅拌器形式、转
15、速等;q 搅拌器的混和计算流体力学的应用研究;q 大型发酵罐高功率搅拌器的加工与动平衡，q 传动装置技术和整体罐结构设计研究;q 。张嗣良，中国生物工程杂志，2005叶勤，发酵过程原理，叶勤，发酵过程原理，2005采用三级种子的谷氨酸发酵工艺 李文东， 发酵科技通讯，2003,7斜面一级种子（1200ml/5000ml三角瓶）二级种子（2m3）三级种子（20m3)发酵（240m3)背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%左右）二级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%以上）文章：三级种子工艺q根据r,Kla、搅拌桨特性搅拌功率KlaN,D(搅拌功率）Q（通气量）大 小小 大5、影响、影响Kla的其
16、它因素的其它因素空气分布器空气分布器液体的粘度液体的粘度氧载体氧载体大罐的空气分布器 通过在发酵液中引入一种新的液相，以减少气液传氧阻力，从而提高传氧效率(Menge et al., 2001; Lowe et al., 1998)。这种液相一般具有比水更高的溶氧能力，且与发酵液互不相溶，称为氧载体oxygen-vector)。通常使用的氧载体主要有:液态烷烃、油酸、甲苯、全氟化碳、豆油等。溶氧水平提高，虾青素合成增加第四节 CL、r和Kla的测定一、一、CL的测定的测定1、化学法、化学法I2+22、溶氧电极、溶氧电极q 极极谱型谱型(阴极阴极)：O2+2H+2e H2O2q 原电池型原电池型
17、(阴极阴极)：O2+2H2O+4e 4OH- 极谱型电极由于其阴极面积很小，电流输出也相应极谱型电极由于其阴极面积很小，电流输出也相应小，且需外加电压，故需配套仪表，通常还配有温度补小，且需外加电压，故需配套仪表，通常还配有温度补偿，整套仪器价格较高，但其最大优点莫过于它的输出偿，整套仪器价格较高，但其最大优点莫过于它的输出不受电极表面液流的影响，且使用寿命长。这点正是原不受电极表面液流的影响，且使用寿命长。这点正是原电池型电极所不具备的。原电池型电极暴露在空气中时电池型电极所不具备的。原电池型电极暴露在空气中时其电流输出约其电流输出约530A(主要取决于阴极的表面积和测试主要取决于阴极的表面
18、积和测试温度温度)，可以不用配套仪表，经一电位器接到电位差记录，可以不用配套仪表，经一电位器接到电位差记录议上便可直接使用。议上便可直接使用。 q 膜：耐温、透气、不通水膜：耐温、透气、不通水q 测定：一般是得到相对值测定：一般是得到相对值二、二、r的测定的测定1、物料衡算、物料衡算 流量（进口空气中氧的氧含量流量（进口空气中氧的氧含量出口空气中的氧含量）出口空气中的氧含量）r= 发酵液体积发酵液体积氧的浓度：氧分压仪氧的浓度：氧分压仪2、溶氧电极、溶氧电极停止供气停止供气：dCL = -r dt三、三、Kla的测定的测定1、亚硫酸盐法（冷膜）、亚硫酸盐法（冷膜）氧氧 亚硫酸钠的氧化亚硫酸钠的
19、氧化Kla.C* = 亚硫酸浓度的降低亚硫酸浓度的降低 Cu2+ 2Na2SO3+O2 2Na2SO42、平衡法、平衡法 rKla= C*-CL例例：一个装料为：一个装料为7L的实验室小罐，通气量为的实验室小罐，通气量为1VVM（标（标态），发酵液的态），发酵液的CL25%、空气进入时的氧含量为、空气进入时的氧含量为21%，废气排出的氧含量为，废气排出的氧含量为19.8%，求此时菌体的摄氧率和，求此时菌体的摄氧率和发酵罐的发酵罐的Kla3、动态法、动态法q 不同的测定方法得出的不同的测定方法得出的kla是不一样的是不一样的第五节 溶氧浓度的变化及其控制一、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定
20、一、典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定Kla下）：下）：rXQCL一般有一个低谷，在一般有一个低谷，在对数生长的末期对数生长的末期华东理工大学学报，2000OUR = r：摄氧率 TEMP：温度AGIT：搅拌转速 DO：溶氧浓度结论： 当OUR(r)与DO反向变化时,表明其限制因素为细胞水平的菌体代谢问题,当OUR(r)与DO同向变化时,表明其限制因素为工程水平的氧传递问题。此时溶氧处于临界氧以下(这一结论)可客观地、动态地把握临界氧水平及氧平衡的制约因素。二、发酵过程中溶氧的控制二、发酵过程中溶氧的控制1、溶氧控制的策略、溶氧控制的策略微生物反应微生物反应: XS P+ X=a+b菌体生
21、长期：菌体生长期：酶系统酶系统 酶系统酶系统 关键因子关键因子开始的细胞开始的细胞生长好后的细胞生长好后的细胞产物合成产物合成产物形成期：产物形成期：底物底物产物产物酶系统酶系统 反应动力学问题反应动力学问题 发酵过程的控制一般策略：前期有利于菌体生长，中后期有利用产物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成。2、溶氧控制的实例、溶氧控制的实例GAXDO谷氨酸发酵谷氨酸发酵：要求：氧饱和度要求：氧饱和度1控制：控制：0-12小时小时 小通风小通风 12小时后小时后 增加通风增加通风原因：原因：0-12小时菌体量较小时菌体量较小，采用小通风小，采用小通风12 一般认为，
22、发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。定要把握好。例：例： 生产肌苷酸：生产肌苷酸：通气量不变通气量不变 17.15 mg/ml24小时增加小时增加 22.55 mg/ml30小时增加小时增加 18.25 mg/ml36小时增加小时增加 12.34 mg/ml
23、初期 与 前期例例：哈哈药药青青霉霉素素发发酵酵的的工工艺艺研研究究*杜文双，中国抗生素杂志，2002三、发酵过程中溶氧浓度监控的意义三、发酵过程中溶氧浓度监控的意义1、考察工艺控制是否满足要求、考察工艺控制是否满足要求2、其它异常情况的表征、其它异常情况的表征 染菌、噬菌体、设备和操作故障染菌、噬菌体、设备和操作故障3、间接控制的措施、间接控制的措施1. 通过搅拌、通气、纯氧控制DO 30%2. 通过DO的变化来监控甘油是否消耗完全3. 通过DO的变化来监控甲醇的补加是否过量第六节：关于厌氧发酵一、厌氧发酵常常被理解为厌氧消化张希衡，废水厌氧生物处理工程,1993二、厌氧发酵是工业生物技术的
24、重要支撑1. L-乳酸L-乳酸 聚乳酸中科院长春应化所和浙江海正集团经过7年的艰苦拼搏，建成了国内规模最大、年产5000吨绿色可降解环保型聚乳酸树脂工业示范线，并成功实现批量生产，它标志着我国已成为世界上第二个聚乳酸产业化规模达5000吨以上的国家，产品质量已跻身世界前列。 2008/04/022. 燃料乙醇美国 2001 496 万吨 目前 840 万吨技术水平 总能耗 原料利用率 副产品国外 600-700kg标准煤 95% 蛋白饲料和CO2 国内 700-900Kg标准煤 50% 酒糟饲料注： 以生产1T燃料乙醇计 酒精的热值 29700 KJ/L 标准煤的热值 29308 KJ/Kg2
25、010年2月3 13美国环保局公布可再生燃料标准第二阶段(RFS2)调整指标：2010：纤维素乙醇：1.00.065；生物柴油8.011.62012：纤维素乙醇：2.50.0650.25姚国新等 中外能源，20113. 生物制氢微藻及蓝细菌光解制氢光能异养发酵制氢厌氧发酵制氢:利用细菌进行有机废水发酵是最有前途的方法哈尔滨工业大学生物制氢技术生产性示范基地 生物制氢产甲烷发酵交叉流好氧高浓度有机废水生物制氢和废水处理综合工艺系统三、氧化还原电位（ORP）的应用 氧化还原反应的本质是电子的转移。物质接受电子的倾向越大，其氧化性就越强，该物质也就是强氧化剂，相反给出电子倾向越大的物质就是强还原剂。
26、 对于一个水体来说，往往存在多个氧化还原电对，构成复杂的氧化还原体系，而其氧化还原电位是多种氧化物质和还原物质发生氧化还原反应的综合结果。 启动负荷为70kgCODm3d、水力停留时问(HRT)为6h、系统pH、氧化还原电位(ORP)分别在4043、-440-470mV之间等条件下，可在30d内完成乙醇型发酵菌群的驯化，实现生物制氢反应系统的快速启动。 容积负荷为40kg/m3d、水力停留时间(HRT)为4h条件下，可以获得CSTR丁酸型发酵的最大产氢速率237m3/m3d此时系统的pH、氧化还原电位(ORP)分别在5255、-480-500mV之间 任南琪 等，环境科学学报，2005 太阳能
27、学报，2005 当ORP为-50mV时的生物量是ORP为-100mV时的1.26倍、ORP为-150mV时的1.86倍、ORP为-230mV时的2.59倍,甘油浓度分别是后三者的1.2倍、1.1倍、1.7倍,而乙醇浓度却分别只有后三者的0.87倍、0.49倍、0.51倍。综合考虑生物量、乙醇浓度、甘油产量、残糖的测定结果,表明将ORP控制在-150mV时对乙醇发酵极为有利。说明可以用ORP电极来精确控制厌氧发酵条件,从而为酵母细胞合理分配代谢流以实现乙醇生产最优化的宏观控制提供了一种有效的手段。王永红等，生物工程学报，2007本章小节： 了解微生物对氧的需求并掌握其中的基本概念 掌握反应器氧的
28、传递方程，及其参数的测定 深入理解Kla的意义，了解反应器放大的基本概念 掌握发酵过程中溶氧浓度的调节方法，并认识监控 溶氧浓度的意义第二章 菌种的来源：q 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力；q 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；q 目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；q 基因重组、直接进化技术的应用等技术的应用， 大大加快了生物产品开发的进程。第三章 发酵培养基：q 培养基菌体生长所需的营养以及其它必须的条件q 了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以 及其中的基本概念q 发酵培养基的优化与设计是发酵工程的基本问题， 掌握发酵培养基优化与设计的思路、了解其中的 方法第四章 种子的扩大培养了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念理解种子扩培的目的和要求掌握控制种子质量的基本方法和手段第五章 发酵动力学的基本概念 了解发酵反应动力学研究的基本内容及其中的基本概念 掌握MONOD方程，及其参数的求解 了解连续培养的特性
