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1、 地球每年陆生植物可产纤维素约51011吨 (5000亿 吨), 我国每年秸秆6-7亿吨 合成速率相当于全人类每人每天70千克 是地球上最丰富的再生资源,约占地球生物总量的 60% 。 80纤维素未被开发利用纤维素的利用前景诱人，但难度不小。纤维素生物质纤维素的显微结构纤维素酶 组成成份及其特征 纤维素酶是生物炼制中的一种重要关键酶。 是水解纤维素-1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖 和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作 用的多组分酶系。 酸性纤维素酶是一种具有310个或更多个组分构成的多 组分酶。依其作用可分为: -1，4-内切葡聚糖酶（Endo-Glucanase ，简
2、称EG,Cx ）,主要作用于无定形纤维素,水解产生纤维糊精,纤维寡糖. -1,4-外切葡聚糖（纤维二糖水解）酶（Cellobiohydrolase ， CBH,C1 ）,主要作用于结晶纤维素,产生纤维二糖. -葡萄糖苷酶（-Glucosidase，G）,水解纤维二糖为葡 萄糖。 纤维素酶分子是由球状的催化结构域（ Catalytic domains,CD）通过一个富含脯 氨酸或羟基氨基酸的连接桥（Linker） 和纤维素结合结构域（Cellulose binding domains,CBD）三部分组成。连接桥的 作用可能是保持CD和CBD之间的距离。 纤维素酶对纤维素的作用机理 天然纤维素酶解
3、过程可分三个阶段：首先是纤维素对纤维素酶的可及性其次是纤维素酶的被吸附与扩散过程最后是由EG、CBH和G自组织复合 体协同作用降解纤维素的结晶区，同时 由EG、CBH和G随机作用纤维素的无 定形区。外切酶C1酶作用于不溶性的固体表面,疏松纤维 素结晶结构并起水化作用，使形成结晶结构的纤 维素链开裂，长链分子的末端部分游离，从而使 纤维素链易于水化。内切酶Cx酶随机水解非结 晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和纤维寡糖、纤 维糊精， -葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水 解成葡萄糖。 结晶纤维素C1无定形 纤维素纤维 二糖G葡萄糖Cx应用纺织 棉布后整理、生物抛光 饲料工业 饲料酶、秸秆青贮 啤 酒 工
4、 业食品及 发酵工业 果汁加工、功能性成分提取 中草药成分提取 酒 精 发 酵玉米酒精红薯酒精 秸秆酒精 纤维素酶水洗牛仔裤秸秆酒精流程影响纤维乙醇产业化的主要因素（1）木质纤维素预处理技术有待进一步优化和提高。由于天然 纤维素原料的结构复杂的特性，使得其纤维素、半纤维素和 木质素三者不能有效分离；另外伴随产生一些中间副产物， 实验表明，这些物质抑制酵母的生长和代谢，最终影响乙醇 产率。 （2）缺乏高效的纤维酶菌株，现有的纤维素酶制剂水解效果较 低，使得酶解糖化经济成本较高，当前生产一吨纤维乙醇需 要酶制剂成本在22002600元。 （3）缺乏能够同时高效利用戊糖和己糖的发酵菌株。在木质纤 维
5、水解中，其中有相当比重的木糖（葡萄糖/木糖约为2：1） 。因此，戊糖的利用是影响纤维乙醇综合成本的关键一项。产纤维素酶的主要微生物 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体 动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产 生纤维素酶。其中微生物主要的有： 霉菌类： 康氏木霉(Trichoderma koningii) 绿色木霉（ Trichoderma viride) 里氏木霉（ Trichoderma reesei ） 腐殖菌（Humicola insolens） 黑曲霉(Aspergillus niger) 斜卧青霉(Penicillium decumbens)、 解纤维顶孢霉(Acremonium
6、 cellulolyticus)等。 产纤维素酶细菌 有粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)， 高温单胞菌属,高温单胞菌(Thermomonospora. fusca) 梭菌属,如丁酸梭菌(Clostridium butyricum) 芽孢杆菌(Bacillus sp.)等。 尤其是一些厌氧菌，如梭状芽孢杆菌(C. thermocellum)和 拟杆菌(B.cellulosolvens)，分泌的纤维素酶具有很高的 比活力，但是它们不能产生高酶效价。 此外栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中 的厌氧性细菌,可产生纤维素酶,对纤维素进行分解，如产 琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球
7、菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁 酸弧菌等。 不同来源微生物纤维素酶的性质比较酶源最适pH最适温度酶组分绿色木霉 里氏木霉 康氏木霉4.5-5.0 (4.8)50-60 EG,CBH, G黑曲霉4.850 EG,G 少量CBH 腐殖菌7.0（耐碱 性）50-55EG,G 少量CBH 嗜碱芽孢 杆菌9.540-45EG纤维素分解菌的筛选方法 纤维素刚果红培养基法：纤维素能同刚果红染料形成红色，而纤维素酶的 水解产物纤维糊精、纤维二糖和葡萄糖不能同刚 果红染料形成红色沉淀，为浅黄色，所以在纤维 素刚果红培养基上，凡能形成浅黄色水解圈的菌 落即是能产纤维素酶的菌株，还可以根据水解圈 的大小（产酶能力强水解
8、圈大），估计菌株产酶 的情况，筛选高产菌株。 磷酸膨化纤维素平板筛选法：纤维素用85%磷酸膨化后，破坏了纤维素的结晶 结构，使纤维素结构蓬松，易于被纤维素酶水解。在 磷酸膨胀纤维素(Walseth)培养基上，用稀释法或划线 法分离出能使磷酸膨胀纤维素降解形成水解透明圈的 菌落，挑选形成透明圈大的菌落，筛选产纤维素酶的 优良菌株。 此外，还有滤纸片、球磨纤维素底物培养基筛选 鉴别方法。 绿色木霉生长在膨化纤维素平板上形成产酶透明圈纤维素酶酶活表示方法 1、滤纸酶活（FPA，FPase） 以滤纸为酶反应底物，该酶活反映综合酶活力，更主要 反映外切酶活 2、羧甲基纤维素钠酶（CMCase) 以CMC
9、为酶反应底物，主要测定内切酶活性 3、 Avicelase 酶活 以微晶纤维素Avicel为酶反应底物，主要测定外切酶活 性4、-葡萄糖苷酶 以水扬素为底物测定；以PNPG（对-硝基苯-D-葡糖 苷）为底物测定。 纤维素被纤维素酶水解所产生的还原糖一般用DNS试剂 检测。纤维素酶活力的定义 在pH4.8，50 条件下测定,酶活单位定义 为水解底物每分钟产生1mol葡萄糖（或产 物）为1个活力单位。 Avicelase 酶活的测定 （以Avicel为酶反应底物，主要测定外切酶活性） Avicel为微晶纤维素，由于Avicel本身有少量还原 糖干扰测定，所以需用去离子水洗涤Avicel 2-3次
10、，去除还原糖，洗涤烘干后的Avicel作为酶活测定 的底物。 称取50mg Avicel，放入20毫升试管底部，加入2ml pH4.8 0.1M Hac-NaAc 缓冲液，放入50水浴中预 热2-3min，加入适当稀释酶液0.5ml，立即计时， 50振荡反应1h，加入3ml DNS溶液终止反应，沸 水浴煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子水， 摇匀后，4000-5000rpm离心5min,上清夜用721分光 光度计于535nm波长下，测定吸光度。以去离子水 代替酶液，同上操作，为参比（OD=0）。羧甲基纤维素钠酶活（CMCase）的测 定 （以CMC为酶反应底物，主要测定内切酶活性）
11、取适当稀释的酶液0.5ml于20ml试管中，放入 50水浴中预热2-3，加入2 ml 1%CMC溶液（用 pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓冲液配制），立即计时 ，50反应30min后，加入3ml DNS溶液终止反应 ，沸水浴煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离 子水，摇匀后，用721分光光度计于535nm波长下 ，测定吸光度。以去离子水代替酶液，同上操作 ，为参比（OD=0）-葡萄糖苷酶（也称纤维二糖水解酶 ） （1）以水扬素为底物测定取适当稀释的酶液0.5ml于20ml试管中，放 入50水浴中预热2-3min，加入2 ml 1% 水杨素溶液（用pH4.8 0.1M Hac-Na
12、Ac缓 冲液配制），立即计时，50反应30min 后，加入3ml DNS溶液终止反应，沸水浴 煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子 水，摇匀后，用721分光光度计于535nm波 长下，测定吸光度。以去离子水代替酶液 ，同上操作，为参比（OD=0）-葡萄糖苷酶（也称纤维二糖水解酶）（2）以PNPG（对-硝基苯-D-葡糖苷）为底物测定 取适当稀释的酶液0.1ml于10ml试管中，放入50 水浴中预热2-3min，加入0.9 ml 0.1%PNPG溶液（ 用pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓冲液配制），立即计时 ，50反应30min后，加入1ml 2%Na2CO3溶液终止 反应，摇匀后
13、，用721分光光度计测定对-硝基苯在 410nm波长下的吸光度。以去离子水代替酶液，同 上操作，为参比（OD=0）纤维素酶高产菌株70-80年代国外主要采用诱变育种方法获得筛 选高产菌，包括随机诱变和有目标诱变，其主要 策略是： 1、解除分解代谢阻遏，解除葡萄糖、甘油等易分解 代谢碳源对产酶阻遏，或筛选2-deoxyglucose抗 性。 2、提高酶的胞外分泌性，如筛选对细胞壁合成抑制 作用的化学物质抗性菌株 3、筛选-葡萄糖苷酶高产菌株，设计- glucosidase作用的有色底物，获得解除分解代谢 阻遏高产突变株。代表性菌株高产菌株国外代表性菌株有 Trichoderma reesei Q
14、M9414, Rut C-30, MCG-77, MCG-80, CL-287, 41GKDR-11,KDG-12,KDD-10等。 国内菌种诱变选育情况 王家林等对康氏木霉NT-15进行紫外线、电 磁波辐射、线性加速器，亚硝基胍等物理 、化学的诱变方法，获得了高产菌株NT15- H,固体培养滤纸活力为3670u/g, Cx酶活力 1800U/g，此菌种在工厂化生产中性能稳定 。 张苓花等采用康氏木霉W-925经过硫酸二乙酯和紫外线复 合诱变，筛选得到产酶活性高的菌种Wu-932 ，该菌种CMC 糖化力达到2975 u/g，滤纸糖酶活性为531U/g，比出发菌 W-925分别提高了100%和8
15、1%。 化工部饲料添加剂技术服务中心采用里氏木霉A3进行紫外 线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双 层平板上，30培养5-8天，15放置7-10天，挑选透明 圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再 筛选，得到了产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。 中科院微生物研究所董志扬等用康宁木霉通过射 线照射和亚硝基胍交替处理，诱变出一株纤维素 酶高产菌株T801，其产酶能力提高1.77倍。 青岛海洋大学管斌等对里氏木霉进行低剂量、反 复多次紫外线、亚硝基胍复合诱变处理方法，用“ 以2-脱氧葡萄糖作为降解产物阻遏物”高效筛选方 法，选育得到一株抗分解代谢阻遏的突变株，纤 维
16、素酶活力提高三倍。纤维素酶基因工程菌构建 20世纪80年代以后一直至今，以纤维素酶过 量生产为主要目的，构建高产纤维素酶基因工 程菌的研究十分活跃。 目前里氏木霉(T reesei)纤维素酶中的 内切酶：EGI、EGIII和EGV基因 外切酶：CBH I , CBH II， -葡萄糖苷酶：GI，GII 等纤维素酶中各组分蛋白分子量，氨基酸残基 组成，基因长度与序列均已被调查清楚。纤维素酶基因工程菌构建策略 由于纤维素酶是一个多酶体系，要得到一个有实 际应用价值的纤维素酶，大多采用产纤维素酶菌 种Trichoderma reesei为外源基因的表达宿主，采 用基因工程手段改造里氏木霉，提高产酶活力。 1、通过扩增内切酶或外切酶蛋白基因的拷贝数， 2、外源-葡萄糖苷基因转入到里氏木霉 3、引入高比活的外源内
