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1、分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物 的分离的分离目标:1、知道纤维素酶的种类及作用2、初步掌握从土壤中分离出分解 纤维素的微生物的实验方法纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶 1.1.纤维素纤维素一种由一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高高 分子分子化合物，是含量最丰富的化合物，是含量最丰富的多糖多糖类类 物质。物质。一、基础知识植物的根、茎、叶等器官都含有植物的根、茎、叶等器官都含有 大量的纤维素。其中大量的纤维素。其中棉花棉花是自然界中是自然界中 纤维素含量最高的天然产物。纤维素含量最高的天然产物。思考：纤维素是地球上含量最丰富的 多糖类物质，植物每年产生的纤维素 超过70亿吨，
2、但却不会在地球上大量 的积累，为什么？纤维素能被土壤中某些微生物分纤维素能被土壤中某些微生物分 解利用，这是因为它们能够产生解利用，这是因为它们能够产生纤维纤维 素酶素酶。土壤中某些微生物能够产生纤维素酶土壤中某些微生物能够产生纤维素酶 , ,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用把纤维素分解为葡萄糖，后再利用 。在草食性动物的消化道内，共生 有分解纤维素的微生物，其产生纤维 素酶而分解纤维素。人没有分解纤维素的能力。人类可应用分解纤维素的微生物将秸人类可应用分解纤维素的微生物将秸 秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理 服装面料等。服装面料等。草食性动物是怎样消化纤
3、维素的？下列生物能分解纤维素的是（ ）人 兔 牛 蘑菇 纤维杆菌A. B. C. D.C即：能分解纤维素的微生物有各种细菌、 真菌和少数放线菌，动物则为草食性动物 。2.2.纤维素酶纤维素酶一种一种复合酶复合酶，它，它至少包括三种组至少包括三种组 分分，即，即C C1 1酶、酶、C CX X酶酶和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条 各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L 的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲 乙在乙试管中加入1mL纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在 140r/min的摇床
4、上振荡1h 结果：乙试管的滤纸条消失讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是 什么？自变量：纤维素酶的有无 自变量的控制：乙试管-1mL纤维素酶溶液甲试管-等量的缓冲液 (不能加蒸馏水，会影响溶液的pH)。实验分析：P27的小实验是如何构成对照？（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法是 _。该方法可以通 过_反应直接筛选。刚果红染色法颜色2、其原理是：刚果红可以与纤维 素形成_，当纤维素被 _分解后，红色复合物无 法形成，出现以_为 中心的_，我们可以通过 _来筛选纤维素分解菌 。红色复合物 纤维素酶 纤维素分解菌 透明圈 是否产生透明圈练一练：1.下列关于纤维素酶的说法，
5、错误的是A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解 菌，下列说法错误的是A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴 别纤维素分解菌 的培养基上挑选产生 透明圈的 菌落分布环境分布环境1.1.土壤取样：土壤取样：富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中操作步骤操作步骤生物与环境的互相依存关系
6、，在富含 纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对 提高，因此从这种土壤中获得目的微生物 的几率要高于普通环境。原因原因实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积 累的枯枝败叶等。累的枯枝败叶等。讨论讨论: :如果找不到合适的环境，可以将如果找不到合适的环境，可以将滤纸滤纸 埋在土壤中。埋在土壤中。将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌 相对集中，实际上是人工设置纤维素分解 菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深 约10cm左右的土壤中。2 2、选择培养、选择培养增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从，以确保能够从 样品中分离所需要的微生物。样品中
7、分离所需要的微生物。目的：目的：制备选择培养基：制备选择培养基：操作：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml30ml选择培养基的锥选择培养基的锥 形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定 温度下震荡培养温度下震荡培养1 12 2天，直至天，直至培养液变浑培养液变浑 浊浊。也可重复选择培养。也可重复选择培养。在选择培养的条件下，可以使那些在选择培养的条件下，可以使那些能够能够适应适应这种营养条件的微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些不适应不适应这种营养条这种营养条件的微生物的繁殖被件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此可以，因此可以起到
8、起到“ “浓缩浓缩” ”的作用。的作用。为什么选择培养能为什么选择培养能“ “浓缩浓缩” ”所需的微生物？所需的微生物？培养基成分分析 培养基组组成提供主要营营养物质质纤维纤维 素粉 5g碳源（能源） NaNO3 1g氮源、无机盐盐KCl 0.5g ，Na2HPO47H2O 1.2g KH2PO4 0.9g， MgSO4 7H2O 0.5g无机盐盐 酵母膏 0.5g生长长因子、碳源、氮源 水解酪素 0.5g氮素、生长长因子溶解后，蒸馏馏水定容至 1000mL水提示：可用牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 ,或者将纤维素改为葡萄糖纤维素改为葡萄糖。A A、旁栏中的配方是、旁栏中的配方是液体液
9、体培养基还培养基还 是是固体固体培养基？为什么？培养基？为什么？ B B、这个培养基对微生物是否具有、这个培养基对微生物是否具有 选择作用选择作用？是如何进行选择的？是如何进行选择的？C C、你能否设计一个对照实验，说明、你能否设计一个对照实验，说明 选择培养基的作用？选择培养基的作用？本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ 课题2是将土样制成的菌悬液直接 涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培 养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素 分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在 鉴别培养基上。其他步骤基本一致。 思考：说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培
10、养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌 选 择 培 养 基原理培养基 类型 目的 鉴 定 培 养 基原理 现象方法将细菌涂布在只有 尿素做氮源的选择 培养基上将细菌培养在只有 纤维素粉做碳源的 选择培养基上固体培养基液体培养基筛选菌株选择培养，增加浓度按照课题按照课题1 1的
11、稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后 的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释1011021031041051064.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养的培养 基上基上制备培养基制备培养基: :参照课本旁栏中的比例配制。参照课本旁栏中的比例配制。倒平板操作倒平板操作。涂布平板：涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各的菌悬液各 取取0.1ml0.1ml涂布到平板培养基上，涂布到平板培养基上，3030倒置培养。倒置培养。挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落
12、( (参照课本刚果红染参照课本刚果红染 色法，挑选产生透明圈的菌落色法，挑选产生透明圈的菌落, ,即为分解纤维素即为分解纤维素 的菌落的菌落.) .)培养基组组成提供的主要营营养物质质 CMC-Na 510g碳源酵母膏 1g碳源、氮源、生长长因子KH2PO4 0.25g无机盐盐土豆汁 100mL碳源、生长长因子琼琼脂 15g凝固剂剂上述物质质溶解后，加蒸 馏馏水定容至1000mL水鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进，再加入刚果红进 行颜色反应。行颜色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5
13、.5.刚果红染色法刚果红染色法挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解 纤维素的菌落。纤维素的菌落。这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法优优优优点点缺点缺点方法一方法一方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本 上是纤维素分上是纤维素分 解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生 混杂混杂操作简便不操作简便不 存在菌落混存在菌落混 杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也 产生模糊透明圈产生模糊透明圈 2.2.有些微生物能降解色素有些微生物能降解色素 ，形成明显的透明圈。，形成
14、明显的透明圈。方法一中NaCl溶液的作用？思考：漂洗作用，洗去与纤维素结合 不牢的刚果红，以免出现的透明圈 不够清晰。比较 项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选 择 培 养原理培养基类 型目的 鉴 定 培 养 基原 理现 象 方 法在细菌分解尿素的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，pH升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如 果pH升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成 红色复合物，当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基 上就会出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈 观察菌落周围是否有红色的 环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现 透明圈来
15、筛选纤维素分解菌脲酶检测法刚果红染色法在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落，挑取的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在，在30300 0C C 37370 0C C培养，可获得培养，可获得纯化培养纯化培养。6 6、纯化培养、纯化培养四、结果分析与评价1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选 出菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明 培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得 了分解纤维素的微生物。2.分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌 的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取 土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌 等不同的分离结果。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。发酵产纤维素酶液体 固体 葡萄糖葡萄糖 五、课题延伸分解 纤维 素的 微生 物的 分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实 验 设 计土壤取样选择培
