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1、CAU 2011第三讲 猪的消化道微生物平衡 及其调控CAU 2011主要内容 main contentsl猪消化道的微生态环境l消化道微生物的检测l猪肠道菌群的建立和演替l猪消化道微生物的功能l猪消化道微生态平衡的调控CAU 2011一、 猪消化道微生态环境CAU 2011 动物消化道微生物 l动物消化道微生物的数量：人和动物消化道内大约有400种 微生物，数量达1014，约是组成动物细胞数量的10倍，（ McCracken和Lorenz，2001）l消化道微生物种类不同动物消化道内正常微生物群的组成不完全一样，但都 由细菌、病毒、衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体、放 线菌和真菌等组成。在
2、70多种已知的细菌门中，人的肠道检测到9门。硬壁菌 门和拟杆菌门构成哺乳动物肠道总细菌16s rRNA（16S rDNA）序列的90%以上，其中硬壁菌门占60-80%，拟杆菌 们占20-40%CAU 2011 猪消化道微生物组成l健康动物消化道的前段主要栖居着大量的乳酸杆菌和厌氧 菌，而且乳酸杆菌的数量调控着整个消化道前段的微生物 菌群平衡（Morotomi等，1975；Conway等，1990） l猪消化道中的梭菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、链球菌、真杆 菌等革兰氏阳性菌属于硬壁菌门，占猪肠道细菌种类的 81%；拟杆菌、噬纤维菌、屈挠杆菌、普雷沃氏菌（含大 肠杆菌属）等革兰氏阴性菌属于拟杆菌门，占
3、肠道细菌种 类的11.2（Leser等，2004）。l硬壁菌门和拟杆菌门占猪消化道细菌的90%以上。CAU 2011 猪消化道主要的微生物 Ewing & Cole, 1994栖瘤胃拟杆菌 Bacteroides ruminicola均一拟杆菌 Bacteroides uniformis产琥珀酸拟杆菌 Bacteroides succinogenes溶纤维丁酸弧菌 Butyrivibrio fibrisolvents产气荚膜梭菌 Clostridium perfringens大肠杆菌 Escherichia coli产气真杆菌 Eubacterium aerofaciens嗜酸乳杆菌 Lact
4、obacillus acidophilus短乳杆菌 Lactobacillus brevis纤维二糖乳杆菌 Lactobacillus cellobiosus发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentumCAU 2011 猪消化道主要的微生物 （续）Ewing & Cole, 1994唾液乳杆菌 Lactobacillus salivarius消化链球菌Peptostreptcoccus productus变形杆菌Proteus spp生黄瘤胃球菌Rumincoccus flavefaciens反刍兽月形单胞菌Selenomanas rumina.牛链球菌Streptococcus
5、 bovis马链球菌Streptococcus equinus粪链球菌Streptococcus faecalis唾液链球菌Streptococcus salivarius韦荣氏球菌 Veillonella sppCAU 2011 消化道微生物的分布 l微生物分布于猪的整个消化道，但不同部位由于组织结构 和生理特征不同，微生物种类和数量也不同。消化道微生 物可分为固定菌群和过路菌群，前者是指在消化道中占有 特定区域的微生物，后者指那些不能在健康动物消化道内 长时间滋生的微生物。l猪粪便菌群与大肠菌群相似，粪便重量的40%是微生物， 而且其中90%以上为活的微生物。l胃：乳杆菌、肠细菌、链球菌和
6、芽孢杆菌等。CAU 2011 消化道微生物的分布（续）l十二指肠和小肠上部微生物较少，回肠末段微生物最多。 从小肠中分离出来的主要细菌包括乳杆菌、双歧杆菌、消 化球菌、肠梭菌和肠球菌等，从十二指肠到回肠末端，总 菌数和活菌数是逐渐增加的，且发酵速度也加强。l猪大肠内的微生物数量最大，主要是严格厌氧菌，也有兼 性厌氧菌，且主要为革兰氏阳性菌，包括链球菌属、乳杆 菌属、真菌属和梭菌属等，革兰氏阴性菌有类菌体属、醋 酸弧菌属和月形单胞菌属等。l盲肠食糜中细菌浓度数为2.371010个/g，粘附于盲肠壁的 细菌数大约为2.67107个/cm2组织表面积（Varel和Yen， 1997），结肠内容物细菌
7、浓度估计为1.331011个/g，粘附 于结肠壁的细菌数大约为5.7107个/cm2组织表面积。CAU 2011 猪消化道不同部位微生物的数量 （log10/g鲜内容物）Henderickx, Decuypere 和 Vervaeke, 1976胃十二指肠回肠盲肠直肠乳酸杆菌7-86-77-88-97-8大肠杆菌5-64-56-77-88梭菌属NilNil0-445肠球菌NilNil0-45-65-6CAU 2011二、 消化道微生物的检测技术CAU 2011 1、传统方法 l显微镜计数法：对未经培养的新鲜样品在显微镜下计数， 不能准确区分不同特征的菌群种类，检测效率很低。l体外培养法常用的手
8、段只能测定出容易培养的部分内源性细菌和一些条件性致病 菌（Stewart, 1997）。许多肠道细菌用体外培养的方法培养不出来，称为不可培 养的微生物。体外培养可能会偏爱某些肠道细菌。CAU 2011 2、1 6S rRNA基因文库的序列计数法 l获取样本中所有细菌的16S rDNA片段，测序获取序列信息 ，并与16S rRNA基因序列数据库中的序列进行对比，明确 其在进化树中的位置，即属于哪个门、刚、目、属、种， 在对特定分类单位下的细菌16S rDNA进行计数，计算其相 对丰度（Ley等，2005）。l对测定结果一般采用系统发育分析法，如距离矩阵法（ distance matrix met
9、hods）、聚类分析法（cluster analysis）以及一系列的简约法进行分析，通过计算获知 该样本在进化树中的位置（Ley等，2005）。 常用的序列 比对软件有MicmSeq、PAUP等。l工作量大，昂贵（每个样本的细菌克隆数200-400个），数 据分析任务艰巨。CAU 2011 3、1 6S rRNA寡聚核苷酸原位杂交法 l设计种属特异性的16S rRNA寡聚核苷酸探针，进行原为杂 交，并计算细菌数量的方法）。l应用广泛，使用方便。l计数麻烦，准确度差。Vargas-Requena等（2002）、 Franks等报道，用原位杂交法30-40%的细菌检测不到。l需要专门的荧光显微镜
10、和图像分析软件。CAU 2011 4、PCR法 l由于16S rRNA 基因序列较短，约1550bp，且保守性较高 ，因此可针对特定种属细菌的16S rRNA 序列设计特意的引 物或探针，并结合Real-time PCR技术检测细菌数量。l由于细菌16S rRNA基因序列存在高度的相似性，且PCR反 应也存在错配的几率，因此，一般情况下需要对新设计的 16S rRNA 引物的特异性进行检验。Matsuki等（2002）设 计了针对B. fragilis、Bifidobacterium、C. coccoides的 引物特异性，之后在NCBI上比对引物序列的特异性，同时 用了7类（约90株）细菌的
11、DNA来做PCR验证这些引物的 特异性。CAU 2011三、 猪消化道微生物的建立与 演替CAU 2011 消化道微生物的建立 l仔猪出生时胃肠道几乎没有微生物，胃肠道微生物首先来 源于出生过程中母体的感染，继而是皮肤、奶头和母猪的 粪便。由于仔猪或多或少地采食母猪粪便，因此母猪粪便 通常是新生仔猪消化道微生物区系的主要来源（ Tannoch等，1990） 。l到822日龄时，仔猪已建立起以双歧杆菌、类杆菌、乳 杆菌、大肠杆菌和消化球菌为优势的微生物菌群（ Moughan等，1982）CAU 2011微生物在猪消化道的定植l细菌在消化道定植的顺序：首先是需氧菌，然后是兼性厌氧 菌，最后是厌氧菌
12、。厌氧菌在开始时之所以不能定植是因为 生存环境中有许多氧，在需氧菌和兼性厌氧菌生长一段时间 后，氧气被大量消耗，厌氧菌才能生长和定植，并在数量上 一直占据首位。l微生物在消化道的定植和演替与仔猪的哺乳有关，也因生理 和环境因素以及消化道生态系统而有差别。例如初生仔猪胃 肠道因盐酸分泌不足而pH值偏高，这样的环境使一些。l一旦固有菌群成功建立后，很少发生变化，甚至在仔猪开始 饲喂固体饲料时也如此。一些次级的固有菌群的定植发生在 仔猪断奶后。CAU 2011四、猪消化道微生物的作用与 调控CAU 2011 消化道微生物的作用 l免疫作用：影响体液免疫、细胞免疫和局部免疫，尤其是 局部免疫。l生物拮
13、抗：对外袭菌入侵有拮抗作用。l营养作用微生物发酵产生的VFA能被猪利用。微生物蛋白质。参与脂类代谢。CAU 2011肠道黏膜表面分泌型IgA的重要作用l采用无菌动物和正常菌群动物进行抗生素处理的研究表明，消化 道正常微生物区系有助于宿主抑制外源入侵的微生物病原体，也 有助于消化所采食的营养物质；维持相对稳定的正常微生物区系 ，对于动物健康具有重要意义。l大量试验表明，猪消化道粘膜固有层中广泛分布着淋巴细胞，这 些淋巴细胞在肠道正常菌群（大肠杆菌、链球菌、肠球菌等）的 刺激下可转化为浆细胞，产生IgA，当IgA通过粘膜上皮到粘膜表 面时成为分泌型IgA。虽然IgA量不多，但主要集中于粘膜表面，
14、抗感染能力很强。IgA可以控制外袭菌的活动，保护固有菌，而固 有菌可以保护分泌型IgA免受降解。固有菌和外袭菌都能刺激淋巴 细胞产生IgA，但IgA只抑制外袭菌，不抑制固有菌，其作用机理 尚不清楚。CAU 2011消化道微生物的营养作用 Coates, 1980益处害处合成B族维生素和维生素K产生有毒代谢产物对食物成分和内源物质有脱毒 作用对营养物质的修饰作用内源氮的再利用消耗养分，如AA产生消化酶，如淀粉酶从非毒性的前体物释放有毒物 质 改变脂肪和胆盐结构而降低脂 肪的消化率CAU 2011微生物区系的稳定性 l平衡状态：猪消化道微生物区系都应保持一定平衡状态，即 需氧菌和厌氧菌、革兰氏阴性
15、菌和阳性菌、微生物种群应保 持一定比例。l胃肠道微生物的平衡状态非常重要，养分的可利用性、食物 流通速度、pH值、温度、氧化还原电位、渗透压、内分泌 机能及厌氧环境等都不同程度地影响微生物区系的平衡状态 。比如健康仔猪，小肠内需氧菌与厌氧菌之比为1:100，即 99%以上的细菌为厌氧菌，大肠两者之比为1:1000，即 99.9%以上的细菌为厌氧菌。仔猪下痢时，二者比例严重失 调，小肠为1:1，大肠为1:100CAU 2011 消化道微生物平衡的调控技术 l抗生素改善猪的健康状况和生产性能过量使用可引起菌群失调，幼畜对病原菌的易感性产生耐药性菌株以及抗生素残留 l日粮营养调整 ：利用乳糖和蔗糖，
16、双歧因子（一些寡糖） 分别促进乳杆菌和双歧杆菌两种主要有益菌的生长l益生素：保护宿主免受病原体侵害，有助于正常菌群发挥功 能和促进有益菌的生长 CAU 2011五 益生菌对猪消化道微生物的调控CAU 2011概 念l概念：活的有益于宿主健康的微生物细胞或微生物细胞成 分，包括益生菌和合生素。l益生菌（Probiotics）：可直接饲喂的微生物（direct fed micro- organism ）。l合生素（Synbiotics）：益生菌益生协同剂。l益生协同剂：可促进有益微生物生长繁殖的物质。CAU 2011 益生菌的作用特点l不产生任何内外毒素l耐受消化道环境和加工过程的破坏l产生特异性细菌素和降低肠道的pH值l能够粘附于胃肠上皮细胞l在胃肠特定部位有足够的活菌数且能增殖l具有营养功能l安全性CAU 2011 益生菌的作用机理l抑制病原菌l生物屏障作用 l提高机体的免疫机能 l与病原菌竞争营养物质 l提供营养物质 CAU 2011我国允许使用的安全微生物菌种干酪乳酸杆菌沼泽红假单胞菌乳酸链球菌产朊假丝酵母菌 嗜酸乳酸杆菌 酿酒酵母
