微生物制药工艺及反应器第五章 微生物发酵及工艺控制

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1、第五章 微生物发酵及工艺控制 第一节 基本概念 第二节 发酵的基本原理 第三节 发酵过程及其工艺控制 第四节 问题分析及处理手段 第五节 发酵过程参数的检测 第六节 发酵过程中的新技术学习目标 了解基本概念、各种发酵方法、发酵基本过程 、发酵过程中的新技术、过程参数检测及其自 动控制； 理解动力学方程，能够运用动力学方程，特别 是分批发酵动力学方程进行计算分析； 熟练分析发酵过程中的各种影响因素及各有关 问题，掌握发酵工艺控制方法及生产中出现的 各种问题的处理手段。第一节 基本概念 菌体量 一般指微生物菌体干重量。 生长期 指微生物接种后，经短暂迟滞期后，至 某种必需营养消耗造成生长限制这一时

2、期。这 一时期微生物快速生长，菌体浓度迅速增加。 生产期 微生物开始积累代谢产物的时期。 二次或隐性生长 由于细胞的自溶作用，一些新 的营养物质，诸如细胞内的一些糖类蛋白质等 被释放出来，又作为细胞营养物质，从而使活 细胞在稳定期又缓慢地生长，通常称二次或隐 性生长。 生长相关型（偶联型） 它的特点是菌体生长、碳源利 用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现 出产物形成直接与碳源利用有关。这一型中又分为两 种情况，即菌体生长型和代谢产物型。其它类型:菌体生长型、代谢产物型、生长不相关 型、生长部分相关型。 临界比生长速率 在发酵过程中，不断有菌体细胞的衰 老和死亡，也不断有生物合成酶系的

3、蜕变与失活。为 了使死亡的细胞和失活的酶系不断得到更新，就必须 保持一定的菌体生长速率。满足这种更新需要，从而 确保产物持续合成（即保持比生产率稳定）的最低比 生长速率称为临界比生长速率，它因菌体细胞的寿命 和酶系的稳定性而异。第二节 发酵的基本原理 一、发酵方法根据发酵条件要求不同，微生物发酵过程 可分为好氧发酵和厌氧发酵。好氧发酵有液体 表面培养发酵、多孔或颗粒固体培养基表面上 发酵和通氧深层发酵几种方法。厌氧发酵采用 不通氧的深层发酵。深层发酵反应在一定径高 比的圆柱形发酵罐内完成。就其操作方式和工 艺流程可分为分批式发酵、流加式发酵、半连 续发酵、灌流式发酵及连续发酵等几种方法。 分批

4、式（Batch fermentation）发酵又称间歇式 (Intermittent fermentation)发酵或不连续式 (Discontinuous fermentation)发酵，也称原位发 酵，是把培养液一次性装入发酵罐，灭菌消毒 后接入一定量的种子液，在最佳条件下进行发 酵培养。经过一段时间完成菌体的生长和产物 的合成积累后，将全部培养物取出，结束发酵 培养。然后清洗发酵罐，装料、灭菌后再进行 下一轮分批操作。 流加式发酵又称单一补料分批发酵（Fed-batch fermentation），是指在分批式操作的基础上， 开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程 适当时期，开始连续补

5、加碳源或（和）氮源或 （和）其它必须物质，但不取出培养液，直到 发酵终点，产率达最大化，停止补料，最后将 发酵液一次全部放出。控制流加式操作的形式有两种，即反馈控 制和无反馈控制。 半连续式发酵(Semi-continuous fermentation)又 称反复分批式或换液式补料发酵。是指菌体和 培养液一起装入发酵罐，在菌体生长过程中， 每隔一定时间取出部分发酵培养物（行业中称 为“带放”），同时补充同等数量的新的培养基 ，然后继续培养，直到发酵结束，取出全部发 酵液。与流加式操作相比，半连续式操作过程 发酵罐内得到培养液总体积保持不变，同样可 起到解除高浓度基质和产物对发酵的抑制作用 。

6、灌流式发酵（Perfusion fermentation）是指菌体 与培养液一起装入发酵罐进行培养，在培养过 程中一方面不断补充新培养基，同时取出部分 条件培养液，但菌体仍然滞留在发酵罐内。灌 流式操作，能及时除去有害的代谢产物，并补 充营养物质，满足了菌体进一步生长的需求。 通过调节灌流速度，可把菌体发酵培养过程控 制在稳定的、低废物水平状态下。 连续式发酵（continuous fermentation）是指菌体与培养 液一起装入发酵罐，在菌体培养过程中，不断补充新培 养基，同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，发酵 体积和菌体浓度等不变，使菌体处于恒定状态的发酵条 件，促进了菌体的生长和

7、产物的积累。连续操作保持反 应体积不变，发酵罐内物系的组成将不随时间而变。连 续发酵使用的反应器可以是搅拌罐式反应器，也可以是 管式反应器。连续发酵的控制方式有两种：一种为恒浊器（ turbidostat）法，即利用浊度来检测细胞生长状况，通过 自控仪表调节输入料液流量，以控制培养液中菌体浓度 达到恒定值；另一为恒化器（chemostat）法，它与前者 相似之处是维持一定的体积，不同之处是菌体的密度不 是直接控制的，而是通过恒定输入的养料中某一种生长 限制基质的浓度来控制。二、发酵动力学 发酵动力学研究内容主要包括：细胞生长和 死亡动力学；基质消耗动力学；氧消耗动 力学；CO2生成动力学；产物

8、合成和降解 动力学；代谢热生成动力学。 菌体生长速率在液体培养基中微生物群体生长，其生长 速率通常用单位体积来表，指单位体积、单位 时间里生长的菌体量；在固体培养基表面上的 微生物群体生长，其生长速率以单位表面积来 表示，指单位时间、单位表面积上生长的菌体 量。 比生长速率是菌体浓度除菌体的生长速 率，或菌体浓度除菌体的繁殖速率。在 平衡条件下，比生长速率 基质的消耗速率 指单位时间、单位体 积发酵液中消耗的基质量，可表示为： 基质的消耗速率常以单位体积发酵液内 干菌体质量表示，称基质的比消耗速率 ，以Qs表示 ms以基质消耗表示的维持代谢系数（维持因 数），维持（M）是指活细胞群体在没有实质

9、性 的生长（即生长和死亡处于动态平衡状态）和没 有胞外代谢产物合成情况下的生命活动。所需能 量由细胞物质的氧化或降解产生。这种用于“维持 ”的物质代谢称维持代谢，叫做内源代谢（对好氧 发酵称“呼吸”），代谢释放能叫维持能。 代谢产物的生成速率指单位体积、单位时间内 产物的生成量，记为up 。如果产物生成速率以 单位体积发酵液内干 菌体质量为基准时， 称产物的比生成速率 ，记为QP 。 当以产物CO2记时，产物的 比生成速率常表示为 。好 氧微生物发酵反应中生成CO2 量相对于氧的消耗，称呼吸 商（RQ）微生物发酵动力学 微生物分批培养动力学方程Monod方程 在特定温度、pH值、营养物类型 、

10、营养物浓度等条件下，微生物细胞的比生长 速率与限制性营养物的浓度之间存在如下关系 ：KS限制性营养物质的饱和常数，g/L。KS 的物理意义为当比生长速率为最大比生长速 率一半时的限制性营养物质浓度。它的大小 表示了微生物对营养物质吸收亲和力大小。 KS越大，表示微生物对营养物质的吸收亲和 力越小；反之就越大。 分批培养中基质的消耗速率 us分批培养中产物的形成速率up 产物形成与细胞生长 部分相关（混合型） 产物形成与细胞生长 相关（偶联型）产物形成与细胞生长 不相关（非生长偶联型 ）第三节 发酵过程及其工艺控制l发酵过程的影响因素 温度温度是指发酵罐中所维持的温度。温度影响微生物 发酵化学反

11、应速度；温度也会影响发酵液的物理性质， 通过影响粘度、溶解氧量、氧的传递速率等间接影响微 生物代谢产物合成；温度也会改变产物合成方向；温度 对菌的调节机制亦有关系。发酵温度取决于发酵过程中能量变化，一般与内在 因素有关。菌体生长繁殖过程中产生的热是内在因素， 称为生物热，是不可改变。另外，与外在因素（搅拌热 、蒸发热、辐射热及冷却介质移出的热量有关。pH值在发酵过程中，培养基的pH值同温度一样影响各种酶 的活性，进而影响产生菌的生长繁殖及产物的合成。pH值 对微生物生长影响很明显，pH值不当，将严重影响菌体生 长和产物合成。不同微生物最适生长pH值和最适生产pH值 不同。发酵过程中pH值的变化

12、是各种酸和碱的综合结果。一 方面是培养基中含有酸性成份（或杂质）。糖被菌体吸收 利用后，产生有机酸，并分泌至培养液中。一些生理酸性 物质（硫酸铵等）被菌体利用后，会促使氢离子浓度增加 ，pH值下降。另一方面水解酪蛋白和酵母粉等培养基成份 ，在其利用后会产生NH3，造成培养液碱性。一些生理碱 性物质（硝酸钠、氨基酸、尿素、氨水等）被菌体利用后 ，将释放出游离NH3或生成碱使pH值上升。溶氧量氧是细胞呼吸的底物，氧浓度的变化对细胞影响很大， 也反映了设备的性能。溶氧量是指溶于培养液中的氧，常用绝对含量表示，也可用饱和氧浓度的百分数表示。溶解氧对菌体生长影响是直接的，适宜的溶解氧量保证 菌体内的正常

13、氧化还原反应。细胞内氧化还原反应乃至物质 之间的转化也需要氧的参与。 菌体质量及浓度生产菌种生长的快慢和产物合成的多少在很大程度上取 决于菌体的质量及菌体的浓度。在适当比生长速率下，发酵 产物的产率与菌体浓度成正比关系。菌浓愈大，产物的产量 就越大。但是菌浓过高，则会产生其它的影响。如营养的物 质消耗过快，培养液的营养成分发生明显的改变，有毒物质 的积累，就可能改变菌体的代谢途径，特别是对培养液中的 溶解氧影响更为显著。为了获得更高的生产率，需要采用摄 氧速率与传氧速率相等时的菌体浓度，即临界菌体浓度。 。培养基培养基的成分对工业发酵生产尤为重要。先进的 培养基组成对高产、稳产和经济发酵的过程

14、是关键因 素。因为培养基组成不仅影响微生物的生长繁殖过程 ，也影响产物合成过程。 二氧化碳二氧化碳是微生物在生长繁殖过程中的代谢产物 ，也是合成某些产物的基质。通常二氧化碳对菌体生 长有直接影响。二氧化碳也影响发酵产物的形成。二 氧化碳可能使发酵液pH下降，进而影响细胞生长、繁 殖及产物合成，二氧化碳可能与其它物质及生长必需 的金属离子发生化学反应形成碳酸盐沉淀，或造成氧 的过量消耗使溶解下降，从而间接地影响发酵产物的 合成。加料方式加料方式有以下三种：一次性加料、一次性投入 主料中间补料方式、连续加料。 泡沫发酵培养液中存在一定数量的泡沫是正常的，泡 沫的存在可以增加气-液接触的面积，增加氧

15、在发酵液 中的传递。但如果培养液中长时间存在大量的泡沫， 则会对发酵产生极其不利的影响：降低了发酵罐的 装料系数；影响了菌体的生长；增加了染菌的机 会；泡沫降低发酵物产量，大量存在时，会从排气 管中排出泡沫，引起“逃液”现象。压力罐压是指罐体内的压力，由压力表读出。培养基灭 菌和发酵过程都需要检测压力变化，罐压的意义在于罐 体内维持正常压力防止外界空气进入造成杂菌污染。因 此，必须使发酵系统压力保持高于外界大气压力，罐压 影响CO2和O2的溶解度，增加罐压，气体溶解度提高， 缩小气泡体积，可避免“逃液”现象。但过高压力影响微 生物DNA复制，使DNA含量下降，从而降低生长速度，高压还降低微生物

16、的硫酸盐还原能力。 搅拌搅拌影响气体的传递速度和发酵液混合均匀程度。 搅拌可以阻止或减少菌丝结成团块和颗粒，减小菌丝和 液体间的扩散阻力，利于溶解氧进入菌体，同时尽快排 出细胞代谢产生的废气和废物，有利于细胞的代谢活动 。产物浓度产物浓度是指发酵液中所含目标产物的量。可以用质量 表示，也可用标准单位表示，如g/ml和效价单位u/ml等。 产物量的高低反映了发酵是否正常，并可判断发酵周期。产物浓度高，设备的生产能力大，便于发酵液的后处理 ，但过分提高产物浓度可能会使设备生产能力下降（因为 要延长发酵时间），也可能造成对菌体代谢抑制或阻遏， 还可能发生其它反应而降低最终产品收得率，对后序处理 不利。产物浓度过高有时也抑制菌体本身生长，对发酵不 利。 发酵时间发酵时间是指菌种接入发酵罐之时起至发酵液从罐内放 出为止的时间间隔。发酵时间尽可能短，还要考虑提高产 物收得率，降低物耗率，以提