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1、 端粒与端粒酶 陈莉南通大学基础医学院早在30年代，两名遗传学家Muller和 Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实 验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重 要，Muller将这一结构命名为端粒（telomere）。 直到1985年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒的 结构为极简单的6个核苷酸TTAGGG序列的多次重 复后发现了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。 端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白 复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性 。端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的RNA 为模板合成端粒的重
2、复序列,以维持端粒长度的稳 定性。许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影 响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细 胞增殖、癌变、凋亡、衰老。 第一节 端粒与端粒酶一、端粒的结构与功能 1972年James Watson提出了“复制末端问题” ，复制DNA的DNA多聚酶并不能将线性染色体末 端的DNA完全复制。也就是说在线性DNA复制时 ，DNA多聚酶留下染色体末端一段DNA（一段端 粒）不复制。端粒DNA复制的特点是在每次DNA 复制中， 每条染色体的3端均有一段DNA无法得到复制， 随着细胞每次分裂，染色体3一末端将持续丧失 50-200bp的DNA，因而细胞分裂具有一定的限度 ，即
3、分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的“分 裂时钟”，反映细胞分裂能力。真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短， 这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分 裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐 渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则 从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂 后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细 胞亦如此。 端粒：是真核细胞线性染色体末端特殊结构。由端粒DNA和端粒相关蛋白组成。端粒DNA：为不含功能基因的简单、高度重复序列,在生物进化过程中具有高度保守性。不同物种的端粒DNA 序列存在差异。人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是 5TTAGGG3的重
4、复序列, 长约15kb。体细胞的端粒有 限长度（telomere restriction fragments TRFS）大多数 明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长 者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短， 主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末 端所致。端粒DNA由两条互相配对的DNA 单链组成, 其 双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2 结合 共同组成t环(t loops)。这种t 环特殊结构可维持染色 体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从 而使遗传物质得以完整复制。缺少端粒的染色体不 能稳定存在。端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色
5、体 的一顶“帽子”，它既可保护染色体不被降解，又避 免了端粒对端融合（end-end fusion）以及染色体的 丧失，同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损 染色体。在生理情况下，端粒作为细胞“分裂时钟” 能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。 二、端粒酶的结构与功能 在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之所 以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长度的 特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机制，它 的染色体末端才面临着致死性缺失（deletion）的危 险。因此在正常人体细胞间永生化细胞（ immortalized cells）及肿瘤细胞的转化过程中可能 也存在着与生殖细胞类似的机制。这些细胞
6、怎样保 持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢？科学家 们发现端粒确实随着每次分裂而缩短，但也会被新 合成的端粒片断再延长。科学家们怀疑，可能尚有 末被发现的酶，该酶具有标准的DNA多聚酶所不具 备的功能，能使已缩短的端粒延长，使科学家们兴 奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使端 粒延长的酶端粒酶的存在。 端粒酶的结构端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶。它是 一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖 方式每次添加一个核苷酸。端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（TERT）端粒酶结合蛋白
7、（TEP） 端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（TERT ）端粒酶结合蛋白（TEP ）端粒酶RNA是第一个被克隆的端粒酶 组分。端粒酶RNA含有与同源端粒DNA 序列TTAGGG的互补序列,核糖核酸酶H 切割此模板区,能使体外消除端粒酶 延长端粒的功能。人类类TERT（hTERT）基因为为一单单拷贝贝基因,定位于5p15. 33 ,具有7个保守序列结结构域单单元和端粒酶特异性结结构域单单元T 。破坏TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩缩短。TEP1、生存动动力神经细经细 胞基因(SMN) 产产物、 hsp90 、 PinX1、 Est1p 和Est3p 1、端粒酶RNA(hTERT) 哺乳动
8、物端粒酶RNAs(hTR和mTR)在许多组织的不 同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛 表达。体内端粒酶RNA 的存在对端粒酶功能至关重要， 影响到端粒酶RNA 的稳定性与突变,也可改变体内端 粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的 末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 。端粒酶RNA转录模板 远端区参与和底物的结合。 近端区能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要。 模板边界区与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶 相关因子Est1p和Ku 结合。2、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT) 几乎所有存在端粒酶的机体均含有
9、一单单独的 TERT 基因, 哺乳动动物TERT 的转录转录 由许许多转录转录 因 子、激素和细细胞外信号严严格控制。不同的转录转录 因 子调节调节 hTERT在不同的细细胞内含物中的表达。癌 基因c-myc是一个受特殊信号调节调节 的可诱导诱导 癌基 因, 并可与HRas、NRas、多瘤病毒MT、LT 等 癌基因协协同作用, 促进细进细 胞无限增殖, 获获得永生 化并发发生癌变变。c-myc 与hTERT Fujimoto等用c-myc 反义义寡核甘酸转转染白血病 细细胞后, 这这些细细胞中端粒酶活性均能被下调调, 而c- myc 正义义寡核甘酸无此作用。Wang等研究发现发现 c-myc在
10、正常人乳腺上皮细细胞和 二倍体成纤维细纤维细 胞中诱导诱导 端粒酶活性, 并能延长长这 些细胞的寿命。因此认为认为 癌基因c-myc为为一重要的端 粒酶激活剂剂。存在于hTERT核心启动动子中有两个重要的c-myc 结结合位点(CACGTG,亦被称为为E 盒)。c-myc 诱导诱导 的 hTERT 表达起始速度快,不受细细胞增殖或额额外的蛋白 合成的影响,与c-myc 引起的直接的转录转录 激活一致。 但癌基因c-myc 不是唯一与hTERT基因调节调节 有关的转转 录录因子。近期研究表明,Sp1 协协同c-myc 激活hTERT的转录转录 , 可能还还有其他因子,如Bcl-2 抗凋亡基因、E
11、6HPV16 型 蛋白，以及经过经过 一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT 上调调 。但在诸诸多不同类类型的瘤细细胞中,致hTERT上调调的基本 激活剂剂是c-myc。TERT内的N-残基对对多种功能是重要的, 包括与端粒 酶RNA结结合、端粒酶RNA 装配和催化作用、与p53 的相 互作用和细细胞永生化。TERT的C-残基也在人类类原始纤维纤维 母细细胞的永生化 、端粒组组装的竞竞争、核仁内定位、引物结结合和渐进渐进 性 延长长等方面起重要作用。 3、端粒酶相关蛋白(TEP) 端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 结合蛋白 ，TEP1 缺失导致rRNA 水平的显著降低以及TEP1 和
12、rRNA 的丢失,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。 生存动力神经细胞基因(SMN) 产物热休克蛋白（hsp）90 、其他涉及到TERT转录后修饰的 蛋白包括磷酸酶-A、Akt 、cAbl 、p53 和PARP。PinX1 与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 这两个蛋白与体内端 粒酶的功能有关。Est1p 足以使端粒延长。但是,在无 Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端 粒长度。 端粒酶的功能端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶 ，它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端 粒酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复
13、序列，具有 逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对 RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能 稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和 干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒DNA 合成。体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程: 受双链端粒结合蛋白包括RAP1 (芽殖酵母) 、存在 于t环的TRF1 (依赖于端粒酶)和TRF2(不依赖于端粒 酶)的负调控。 第二节 端粒端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响“端粒端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永 生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的 端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条
14、件。 相对地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被认为是细胞永 生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实,端粒酶 对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的 。 细胞的死亡过程分为两个阶段, 当端粒缩短至一 关键性长度2kb-4kb 时,染色体的稳定性就会遭到破坏 ,细胞开始衰老进入M1期（mortality stage1 M1）。在M1 期细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑 制因子，细胞周期检查点（cell cycle checkpoints）发 送周期停止信号，DNA合成停止，DNA 断裂,活化p53 依赖或非p53 依赖的DNA 损伤途径。并诱导细胞周期 依赖性激酶（CDK
15、）抑制物如p21 ,p27产生,导致细胞 G1期生长停滞,最终走向死亡。如果这一过程中一些癌 基因SV40T抗原、PRB ,p53 ,p16 等抑癌基因失活,丧 失正常功能, 均能使M1期的机制被抑制使细胞逃逸M1 期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为 阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，最终到达 M2期。细胞由于端粒过短,基因不稳定,绝大多数细胞 死亡,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激 活,端粒的功能得到恢复,基因重获稳定,使细胞超越M2 期,成为永生化细胞。 端粒酶被抑制正常人体细胞端粒丢失M1期阻滞 SV40T抗原细胞分裂停止 Rb、P53与病毒蛋白结合、突变M1M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化染色体失稳 端粒酶被激活细胞凋亡 端粒酶在人体细胞永生性转化中第三节 端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响 一、端粒酶对细胞周期的影响端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所 处阶段不同,端粒酶活性亦不同, 端粒酶活性与细胞 周期CDK-CKIs 网络调控系统有关 。实验发现永生 化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性,而静 息细胞中活性降低,随着肿瘤细胞进入G1/S 期,端粒 酶活性逐渐升高,在复制S 期端粒酶活性最高,而在 G2/M期端粒酶活性逐渐丧失,当培养细胞处于无血 清而进入G0 期时,端粒酶活
