免疫组织化学

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1、免疫组织组织 化学 ImmunohistochemistryWSouth China Normal U 组织化学（histochemistry）是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细 胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学，是介于这些学科之间的一门边缘 科学。组织化学自出现以来，已取得了长足的发展。这与相关学科的发展是分不开的，其中细胞生物学、生物化学以及分子生物学是组织化学形成和发展的基础。South China Normal U免疫组织 化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支，它是

2、用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。South China Normal U组织组织 化学发发展简简史组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来的，它的历史相当悠久。早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合起来，开始观察组织中的化学反应。如法国植物学家F.V.Raspail（1826）介绍了植物花和果受精过程中的碘淀粉反应；M. Perls（1867）用普鲁士蓝显示出铁；A.N.F. Millon(1844)叙述了蛋白质反应； R. Frnrohr（1850）论述了纤维素的氯锌碘法； South China Normal U Klebs(1868)

3、和H. Stuve1872)用愈创木酯酊同脓作用产生蓝色证明组织中有过氧化物酶的存在；P.Ehrlich(1885) 发现了细胞色素氧化酶；R. Heidenhain(1868) 指出动质（ergastoplasm）核糖核酸是一种嗜硷性物质，可被醋酸沉淀；F. Miescher(1873)利用甲绿对核染色质的选择性亲和力，分离出核染色质。South China Normal U自A. Bencke(1862)将苯氨染料用于组织学领 域，许多研究者在组织中应用了染色反应，相继各种蛋白质被染色出来。到19世纪末，胶原蛋白染色，脂肪的苏丹染色以及组织中金属盐类 的显色等技术方法得到发展。但是由于化学

4、知识的贫乏和显微镜技术的停滞在一定时期限制了组织化学的发展。South China Normal U 20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时 代。自从E. Takamatsu（高松英雄）和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。South China Normal U免疫组织 化学发展简史1941年 Coons 首先用荧光素标记 抗体检测 肺组织内 的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Nakane建立

5、酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶抗体过氧 化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。South China Normal U 80年代 Hsu 等建立了抗生物素生素（ABC） 法之后，免疫金银染色法、半抗原标记法、 免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学 各个学科，是目前生 命科学工作者应 该掌握的基本技术之一。South China Nor

6、mal U免疫组织 化学实验 基本步骤 1、取材 2、固定 3、切片 4、反应 5、显色 6、观察（结果）South China Normal U 取材：把实验目标组织从动 物身体上取下的过程。 脱臼法 断头法 空气栓塞法 注射毒药法 South China Normal U以石蜡切片为例简要介绍HE流程 固定： 组织块 大小：1.51.50.2 CM 固定液4倍组织体积 South China Normal U1. 酒精固定 纯酒精有较大的收缩力，固定时先用80%酒精固定数小时，然后换95%酒精。优点：（1）尿酸结晶和糖类，用100%乙醇固定 （2）别的固定液固定后，80%乙醇保存 （3）边

7、固定边脱水缺点：（1）核染色不良 （2）脂类不行 （3）色素不行 （4）表面发硬，块大不行 South China Normal U2 福尔马林固定 市售为40%甲醛水溶液，应放入小量碳酸钠放置一段时间 福尔马林固定液：40%甲醛溶液1份，水9份 固定数小时后用水洗24小时 优点：克服了乙醇固定的缺点 苦味酸固定 以苦味酸饱和水溶液储存，固定后的组织经 酒精脱水即可。 South China Normal U常用固定液配方： Bouin氏液 苦味酸饱和水溶液 75mL 40%福尔马林 25mL 冰醋酸 5mL 渗透速度快，对于小块组织 只须固定数小时，组织收缩很少，着色良好，不使组织变 硬和变

8、脆。固定后的组织经水洗涤12小时，即投入酒精脱水。 South China Normal U Garnoy氏液 纯酒精 6mL 冰醋酸 1mL 氯仿 3mL 固定组织块 1-2小时，以后以95%的酒精和纯酒精脱水即可包埋。适宜于固定DNA和RNA。 South China Normal U脱水（组织块 ） 70%乙醇 片刻80%乙醇 2-4小时95%乙醇 2-4小时95%乙醇 2-4小时100%乙醇 2-4小时100%乙醇 2-4小时注：为保证100%乙醇无水，可在容器中放入无水硫酸铜吸收水分，变蓝 后更换。最好能将100%乙醇中取出来的组织 浸入香柏油后再经二甲苯后浸石蜡。 South Ch

9、ina Normal U透明（组织块 ） 100%乙醇：二甲苯（1：1） 15分钟 二甲苯 15分钟 二甲苯 15分钟 注意：时间太长变脆South China Normal U浸蜡（组织块 ） 石蜡熔点 5256 温箱：56 二甲苯：石蜡（1：1）1-2小时 石蜡 1-2小时 石蜡 1-2小时 （过夜最好，大约12小时，特别是对块较大的组织）South China Normal U包埋 将熔化了的石蜡倾入包埋框内，随即迅速将组织块 用加温了的镊子送置于框内，平置底面。注意组织切面，放入冷水，冷固后将蜡块修齐，固定于木块上。 South China Normal U石蜡切片 切片机：调整好。刀

10、：磨刀时一个方向，液体石蜡。切下的片子，右手用弯镊子轻轻钳 牢石蜡切片，左手用干燥毛笔将切片取下，放入盛温水（约30）的玻璃皿内，将切片摊于温水面上，光亮的切面向下，用弯镊子细心张开皱纹 。然后将水温加到40，使切片更平均地展开于水面上，再用弯镊子细心分开各蜡片，将涂过少许蛋白甘油的载玻片沉至切片下面，然后将切片从水面取出。最后将切片置于56保温箱内烘干，需时2小时。刀的倾角：2030冬天石蜡52-54，夏天56-58 South China Normal UH.E.染色 固定于10%福尔马林，80%酒精 石蜡切片 二甲苯2-5分钟（冬季56温箱） 二甲苯2-5分钟（冬季56温箱） 100%乙

11、醇1min 95%乙醇1min 80%乙醇1min 70%乙醇1minSouth China Normal U先用自来水而后用蒸馏水洗0.5minHarris氏苏木紫液5min。苏木紫为盐基性染料可染细胞核。在冬季可预先放入保温箱内，使染剂保持在30左右，如此染5min即已足够。染色时间与气候和染液的浓度都有密切关系，须灵活掌握。自来水洗2秒钟。用1%酸性酒精（1mLHCl和99mL70%酒精混合液）分化5秒钟。用自来水洗少许时候，而后入饱和碳酸锂水溶液中，使切片变蓝色，共需时约10秒钟。（此步后须用镜检细 胞核是否适当，如细胞核过淡，可用自来水和蒸馏水洗一下，再用苏木紫重染，如细胞核过深，可

12、用水洗一下，再在酸酒精中分化一下，其余步骤与上相同。此步骤镜检 很重要，不可忽视。）充分流动自来水冲洗2-10min，冲洗时间愈久，分化愈清楚（但不要超过12小时）。而后入80%酒精中1分钟。 South China Normal U 入0.5%伊红酒精溶液中1-2min（伊红为酸性染色剂，可染细胞浆，100mL溶液中加入1-2滴冰醋酸，冰醋酸为促染剂，使伊红容易着色，经酒精是不易脱色）。 经95%乙醇脱水2min 经95%乙醇脱水2min 经100%乙醇脱水1min 经100%乙醇脱水1minSouth China Normal U 浸入石炭酸二甲苯混合液（1：3）透明和吸水5min。 再经

13、二甲苯1min洗净石炭酸，并使其更为透明。 再经二甲苯1min，切片自二甲苯中取出，用干纱布揩净切片以外的二甲苯，立刻滴上一小滴加拿大树胶液，并迅速用镊子取洁净盖玻片盖上（勿留气泡）。 结果：细胞核呈蓝紫色，细胞浆呈红色。 South China Normal UHarris氏苏木紫染色液传统 配制 法 甲液：苏木紫 1g 100%乙醇 10mL（可稍加热使苏木紫溶解于酒精中）乙液：钾明矾 20g 蒸馏水 200mL（可稍加热使明矾溶解于蒸馏水中）混合甲乙二液，煮沸后，即加氧化汞（HgO）0.5g，热至染液变深紫色，立即将烧瓶放入流动冷水中冷却。次日进行过滤 ，可暴露于日光中，使其氧化为苏 木红，这个过程叫做成熟。使用时加冰醋酸4mL，可增加细胞核染色。 South China Normal U 国内病理组织切片的“HE”染色中, 多使用哈瑞苏木素试剂为染液, 在配制中存在如下四个问题: 一是需火源煮沸, 二是使用的氧化剂为氧化汞, 易造成环境污染及对人体健康影响, 三是配制过程较复杂不