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1、浅谈基质效应n基质效应产生的原因和影响n基质效应的确认方法n基质效应的消除浅谈基质效应基质效应的产生原因基质效应的产生原因n所谓基质，指标本中除分析物以外的一切组成。以测定血 中红霉素的浓度为例，除了红霉素之外的蛋白、磷脂及其 他内源性物质皆为基质。 基质效应，按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）文 件的定义为 标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响 ； 基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说 来，基质效应也应包括已知的干扰物（如红霉素测定中磷 脂、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基 质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘 度、pH等）的影响。
2、基质效应的产生原因n主要针对使用液相色谱-质谱联用技术分析生物样品中的化 合物所产生的基质效应进行讨论。n而在生物样品（以血浆为例）中，引起基质效应的主要是 磷脂、胆固醇等内源性物质。他们随同待测物从色谱柱上 一起被洗脱出来，经离子源气化，进入质谱进行检测分析 。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液滴直至产生气 体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同 待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化 效率降低或增强，引起响应降低或增高，这就产生所谓的 基质抑制或基质增强效应。n根本原因是什么？n基质效应会产生哪些不好的影响基质效应的产生原因n标准曲线法n柱后灌注法n监控法基质效应
3、的确认方法n样品配制方法：配制三种不同的标准曲线（每条标准曲线7 个点，每一种配制方法五样本）1、药物+内标：用流动相稀释到一定浓度 2、药物+内标：用含有5种不同来源的空白生物样品的流动 相 稀释 3、正常配制的生物样品标准曲线法n评价方法：通过比较3组标准曲线待测组分的绝对响应值、待测组 分与内标的响应值比值和标准曲线的斜率，可以确定基质 效应对定量的影响。标准曲线法绝对响应值比较n第1组测定结果可评价色谱系统和检测器的性能以及整个系 统的重现性。n第2组测定结果同第1组测定结果相比，若待测组分响应值 的相对标准偏差明显增加，表明存在基质效应的影响。n第3组测定结果，若待测组分响应值的相对
4、标准偏差明显增 加，表明存在基质效应和提取回收率因血浆来源不同而不 同的共同影响。标准曲线法绝对响应值比较n如果将第1组、第2组和第3组测得的相应的响应值分别用A 、B、C表示，可按下列公式分别计算基质效应(ME)，提取 回收率(RE)和方法效率(PE)：nME( )=BA100 (1)nRE()=CB100 (2)nPE()=CA100=(MERE)100 (3)n公式(1)计算得到的ME为绝对基质效应。相对基质效应通过 对不同来源样品间的B值进行比较获得。当ME值等于或接近 100时，表明不存在基质效应的影响；当ME值大于100时， 表明存在离子增强作用；当ME值小于100时，表明存在离子
5、 抑制作用。标准曲线法n待测组 分与内标的响应值 比值和标准曲线的斜率nStandard line slopes as a measure of a relative matrix effecting quantitative HPLCMS bioanalysisnThe results of these studies indicated that the variability of standard line slopes in different lots of a bio fluid precision of standard line slopes expressed as coe
6、fficient of variation, CV (%) may serve as a good indicator of a relative matrix effect and, it is suggested, this precision value should not exceed 3 4% for the method to be considered reliable and free from the relative matrix effect liability.标准曲线法n另外，有学者建议使用低、中、高三浓度的质量控制样品 （QC）来评价基质效应的大小；有人建议使用定
7、量下限（ LLOQ）水平的6个个体的基质来评价。标准曲线法n将空白生物样品的提取液和空白溶剂分别进样进行液质分 析，同时利用注射泵将含相同浓度待测物的标准溶液通过 色谱柱与质谱接口之间的三通注入到色谱柱流出液中。如 果同空白溶剂的萃取离子图谱相比，空白提取液的萃取离 子图谱的响应信号明显减弱或增强，则表明存在基质效应 的影响。柱后灌注法 (Post-column infusion method) 柱后灌注法n样品配制：分别用液液萃取（正己烷-异丙醇）、固相萃取 、沉淀蛋白（乙腈沉淀和高氯酸沉淀） 1、正常配制空白样品 2、用水代替血浆配制样品 3、流动相柱后灌注法液液萃取ESI固相萃取乙腈沉淀
8、高氯酸沉淀液液萃取固相萃取乙腈沉淀高氯酸沉淀APCIn由于基质效应是无法监测的，所以消除困难。如果能够用 一种物质代表基质效应，那么我们就能够直观的看到基质 的具体保留行为，从而分离基质与待测物，消除基质效应 。监控法nSystematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses Erin Chambers , Diane M. Wagrowski-Diehl, Ziling Lu, Jeffrey R. Mazzeo监控法nIn our studies, we evaluate s
9、everal sample preparation methods, including protein precipitation (PPT), liquidliquid extraction (LLE), silica-based solid-phase extraction (SPE) and polymeric SPE. Because endogenou phospholipids have been identified as a major source of matrix effects by multiple researchers, we monitor the level
10、s of the various phospholipids in the samples to compare relative cleanliness of final plasma extracts.监控法监控法n选择合适的样品制备方法n优化色谱条件n质谱条件的选择 n内标物的选择 基质效应消除选择合适的样品制备方法总体来讲，基质效应是与生物样品处理不干净密切相关 的。我们可以通过稀释处理后的溶液或者降低进样量，来 降低基质效应对测定的影响，但这是治标不治本，背景噪 音在降低的同时，待测物的响应也降低，对改善我们的测 定灵敏度没有太大好处。其实，更为关键的是选择合适样 品前处理方法。基质
11、效应消除基质效应消除n我们在生物分析中主要用到沉淀蛋白法（PPT）、液液提取 法（LLE）和固相萃取法（SPE）。PPT适应于绝大多数化合 物，对蛋白结合率的高低没有要求，操作步骤相对简捷， 缺点就是处理后的样品不是很干净，内源性物质较多，从 而产生较强的基质效应；LLE适于极性相对小、蛋白结合率 低的化合物，提取步骤相对繁琐，但处理后的样品尤为洁 净；而SPE根据填料的不同，适于分析的化合物的种类也有 所差别，目前市面上有SPE小柱和SPE 96-well板，该方法 特点是样品处理后干净，操作装置简单，绝大数的内源性 物质被去除，使待测物浓缩，提高检测的灵敏度。优化色谱条件n基质效应的产生，
12、是由于内源性物质与待测物一同流出色 谱柱，从而产生竞争抑制引起的。优化色谱条件，改变内 源性物质与待测物在色谱柱上的保留时间，使其流出的速 度不同，从而进入质谱的时间不同，这样就可以去除或降 低基质效应的影响。比如待测物易离子化，那么调节样品 或溶液中的pH值，会对它的保留、选择性和灵敏度产生很 大的影响。n如果有切换阀，最好把样品峰出峰前一分钟之前的都切换 调 。基质效应消除请看下面两图，色谱条件优化前 基质效应消除色谱条件优化后 基质效应消除n从优化后的色谱图中，可以看出在4.2min左右有部分内源 性物质的小峰出现，这说明如果化合物在这时候被洗脱下 来，那么内源性物质就会一同下来，同时进
13、入离子源，从 而产生基质效应。为了避免这个问题，我们优化了色谱条 件，将洗脱程序变缓，使内源性物质和待测得化合物分开 ，这样就减小了基质效应。 基质效应消除质谱条件的选择 n众所周知，基质效应在液质检测中有所体现，但在液相-紫 外检测中却没有，这跟它们检测的原理是相关的。在液质 分析中，我们经常使用的是电喷雾离子源（ESI）和大气压 化学电离源（APCI）。ESI源由于其电离原理是液相离子 化，内源性物质与待测物竞相竞争液滴表面，从而基质效 应比较明显。所以我们在实际应用中，如果遇到使用ESI源 基质效应较大，可以考虑换用APCI源尝试一下，看看响应 是否能够满足要求，基质效应是否有所降低。n
14、同时，我们还可以考察一下正离子检测模式和负离子检测 模式下基质效应的大小，一般情况下，负离子的背景噪音 要低于正离子的。 基质效应消除内标物的选择n在生物分析中，由于样品处理过程复杂，为了保证其操作 的准确性，要使用内标来校正操作的误差。内标的选择， 主要从同位素标记物和待测物的同系物里寻找。实际上， 同位素标记物是最为理想的内标物，它与待测物的化学性 质极为相似，基质效应、操作中的环境变化等对他们的影 响也一致，这样就可以出去基质效应的影响。但是由于同 位素标记物价格昂贵，而且不易获得，使这种优越性大打 折扣，在不得已的条件下，还需要选择同系物来做为内标 ，这就需要通过其他几个方面来尽量的降低基质效应，以 满足测定灵敏度和专属性的要求。 基质效应消除FDA关于基质效应的规定nFDA在生物样品分析方法确证中对基质效应的规定凡 是使用液质建立生物样品分析方法时，必须考察基质效应 对化合物测定的影响。当基质的影响控制在LLOQ的20%以 下，这个方法才能被接受。n基质效应产生的原因n柱后灌注法的原理是什么n标准曲线法需要配制哪些样品n通过哪些方法消除或降低基质效应问题
