基因工程和基因组学

《基因工程和基因组学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程和基因组学（80页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第十二章 基因工程和基因组学第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程 l 一、基因工程概述:广义遗传工程包括:生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义遗传工程是指:基因工程(重组DNA技术)。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式 按照预先设计的蓝图 借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去 使后者定向获得新遗传性状的一门技术。基因工程技术的建立，使实验生物学领域产生巨大变革。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l 2. 发展：1971年，史密斯（Smith H.

2、O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶 酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年，伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 得到新的DNA分子。1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中。第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l 1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1985年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1996年，克隆羊诞生。 第十二章 基因工程和基因组学第一

3、节 基因工程l近年全世界转基因植物种植面积 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l2001年种植面积100万公顷的转基因作物：大豆（3330万hm2，占全世界转基因作物的63%，均为抗除草剂大豆）、玉米（980万hm2 ，占19% ）、棉花（680万hm2 ，占13% ）、油菜（270万hm2 ，占5% ）；其它还有水稻、小麦、花生、日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已培育成功。主要分布在美国（3570万hm2）、阿根廷（1180万hm2）、加拿大（320万hm2）和中国（150万hm2）等国。第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l下图为20

4、01年全世界转基因作物占相应作物种植总面积的比较：第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l 2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l3内容：从细胞和组织中分离DNA；限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；将酶切DNA分子与载体DNA连接 构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；把重组DNA分子引入宿主受体细胞 复制；第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l 重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞 建立无性

5、繁殖系(clone)或发育成个体；从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系 并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异的个体。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l五、基因工程的应用：l目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l、基因工程工业：最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。现已在细菌中生产10多种药品，例如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。目

6、前，酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞均成功地应用于表达外源蛋白。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l、植物基因工程：植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。许多植物基因已经被分离、克隆。农杆菌转化法和基因枪转化法应用最多。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l、转基因动物:转基因动物：目的基因载体 重组DNA 微量注射法将重组DNA导入受体合子细胞核 遗传转化。如：利用转基因羊 大量表达人类的抗胰蛋白酶。可分泌人类生长因子的转基因羊“Polly” 。下图为Wilmut等，Na

7、ture 385, 1997。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l左下图为受精卵细胞注射法，右下图为转基因牛（受精卵注射法）。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程下图中左边小白鼠为转移有人类生长 下图中的猪为人类生长激素转基因猪激素转基因鼠，右边为同胞鼠对照。第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l、遗传疾病诊断：利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断，是直接从DNA即基因水平进行诊断 准确度高，速度快。如进行产前诊断，分析胎儿是否有遗传疾病。 第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程l、基因治疗：特异基因导入并整合到有遗

8、传缺陷患者基因组中 治疗遗传疾病，通常叫做基因治疗(gene therapy)。方法：减毒的病毒DNA作载体(retro virus DNA) 构建重组DNA分子 用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞 将正常基因整合到染色体上。第十二章 基因工程和基因组学第一节 基因工程lSCID是由于腺苷脱氨酶基因(adenosine deaminase，ADA)突变引起，患者无任何免疫功能。2000年法国Fischer用该方法治愈患有SCID遗传病的两个婴儿(8个月和11个月) 被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。 方法：将ADA基因导入到MLV retro virus 载体 取代该病毒D

9、NA中的三个基因结构(gag、pol、env) 将重组后的病毒去感染T细胞，使ADA基因整合到T细胞的染色体中 实现基因治疗的目的。 第十二章 基因工程和基因组学第二节 基因组学 六、转基因植物安全性l（1）外源基因的毒性l（2）潜在过敏反应问题l（3）抗生素抗性风险问题l（4）营养品质改变问题l（5）“超级杂草”及生物多样性第十二章 基因工程和基因组学第二节 基因组学 l 基因组学(genomics) ：遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体内基因组的分子特征。* 研究对象：以整个基因组为研究单位，而不以单个基因为单位作为研究对象。* 研究目标：认识基因组的结构、功能和进

10、化；阐明整个基因组所包含的遗传信息和相互关系；充分利用有效资源，预防和治疗人类疾病。第十二章 基因工程和基因组学聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）lKary mullis 等人发明，1993年获诺贝尔化学奖。 1944年生于美国，乔治亚理工科大学毕业后，在加利福尼亚大学伯克利分校获得博士学位。1979年任塞托斯公司的研究员。 1988年，使用来源于水生栖热菌的耐热 DNA 聚合酶，建立了PCR技术。 PCR 技术是生命科学领域中的一项革命性创举和里程碑。 第十二章 基因工程和基因组学l原理简介：PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制。由于DNA复制

11、是半保留的，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。第十二章 基因工程和基因组学第十二章 基因工程和基因组学l变性：基因组DNA在95 下加热30 Second左右，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。l退火：将反应混合物降温至55，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，形成模板-引物复合物。l延伸：迅速加入TaqDNA 聚合酶，混匀。置反应混合物于72，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从

12、引物3端开始，沿着53的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。第十二章 基因工程和基因组学l经一个循环，双链DNA拷贝数增加一倍。进行n次循环，拷贝数将增加2的n次方倍，如进行25-30个循环，拷贝数即扩增上百万倍。第十二章 基因工程和基因组学lPCR产物电泳检测核酸提取及常见问题分析第十二章 基因工程和基因组学第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第十二章 基因工程和基因组学核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究

13、的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。前言前言第十二章 基因工程和基因组学第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第一部分：DNA提取方法简介第十二章 基因工程和基因组学DNADNA提取的几种方法提取的几种方法q 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它第十二章 基因工程和基因组学DNADNA提取的几种方法提取的几种方法q 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法

14、第十二章 基因工程和基因组学基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法q CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。第十二章 基因工程和基因组学q CTAB提取缓冲液的经典配方组组份T

15、ris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB-巯巯基乙醇终浓终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V） 使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法第十二章 基因工程和基因组学q CTAB提取缓冲液的改进配方组组份Tris-HCl

16、（pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯巯基乙醇终浓终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使 用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法第十二章 基因工程和基因组学q CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法第十二章 基因工程和基因组学方法的简析l冷冻和研磨，使细胞核破裂l加入提取缓冲液，溶解DNAl氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白l加入异丙醇，沉淀DNAl酒精冲洗，去除剩余杂质lRNase消化，去除RNAl无菌水溶解，保存DNA第十二章 基因工程和基因组学电泳图解析第十二章 基因工程和基因