二十超临界色谱2

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1、20-5 超临界流体色谱法简介 超临界流体色谱法（Supercritical Fluid Chromatography ,SFC）是以超临界流体作为流动相的一种色谱方法。所谓超临界流体，是指既不是气体也不是液体的一些物质，它们的物理性质介于气体和液体之间。超临界流体色谱技术是2O世纪80年代发展起来的一种崭新的色谱技术。由于它具有气相和液相所没有的优点，并能分离和分析气相和液相色谱不能解决的一些对象，应用广泛，发展十分迅速。据Chester估计，至今约有全部分离的25涉及难以对付的物质，通过超临界流体色谱能取得较为满意的结果。1超临界流体的特性 (1) 物质的临界点我们知道，某些纯物质具有三相

2、点和临界点。 纯物质的相图见图20-s1由三相图看出：物质在三 相点下，气、液、固三态处于平衡状态。而在物 质的超临界温度下，其气相和液相具有相同的密 度。当处于临界温度以上，则不管施加多大压力 ，气体也不会液化。在临界温度和临界压力以上 ，物质是以超临界流体状态存在。即在超临界状 态下，随温度、压力的升降，流体的密度会变化 。此时的物质既不是气体也不是液体，却始终保 持为流体。临界温度通常高于物质的沸点和三相 点。（2）超临界流体的特性 超临界流体具有对于分离极其有利的物理性质 。它们的这些性质恰好介于气体和液体之间。超临 界流体的扩散系数和粘度接近于气相色谱，因此溶 质的传质阻力小，可以获

3、得快速高效分离。另一方 面，其密度与液相色谱类似，这样就便于在较低温 度下分离和分析热不稳定性、相对分子质量大的物 质。另外，超临界流体的物理性质和化学性质，如 扩散、粘度和溶剂力等，都是密度的函数。因此， 只要改变流体的密度，就可以改变流体的性质，从 类似气体到类似液体，无需通过气液平衡曲线。超 临界流体色谱中的程序升密度相当于气相色谱中程 序升温度和液相色谱中的梯度淋洗。通常作为超临界流体色谱流动相的一些物质， 其物理性质列在表20-1中 2超临界流体色谱仪 1985年出现第一台商品型的超临界流体色 谱仪。图20-s6表示了超临界流体色谱仪的一般 流程。图中很多部分类似于高效液相色谱仪，但

4、有 两点重要差别：（l）具有一根恒温的色谱柱。这点类似气相 色谱中的色谱柱，目的是为了提供对流动相的 精确温度控制。（2）带有一个限流器（或称反压装置）。目 的用以对柱维持一个合适的压力，并且通过它 使流体转换为气体后，进入检测器进行测量。 实际上，可把限流器看作柱末端延伸部分。3压力效应在SCF中，压力的变化对容量因子k产生显著影 响，由于以超流体作为流动相，它的密度随压力增 加而增加，而密度的增加引起流动相溶剂效率的提 高，同时可缩短淋 洗时间。例如，采用CO2流体作流 动相，当压力由7.O106Pa增加到90106Pa时，对 于十六碳烷烃的淋洗时间可由25min缩短到5min。在 SFC

5、中，通过程序升压实现了流体的程序升密，达到 改善分离的目的。4.固定相和流动相用于SFC中的色谱柱可以是填充柱也可以是 毛细管柱，目前，毛细管超临界流体色谱（ CSFC）由于具有特别高的分离效率，倍受人们 的青睐。在SFC中，最广泛使用的流动相要算是CO2 流体，它无色、无味、无毒、易获取并且价廉， 对各类有机分子都是一种极好的溶剂。它在紫外 区是透明的；临界温度31，临界压力 7.29106Pa；在色谱分离中，CO2流体允许对温 度、压力有宽的选择范围。有时可在流体中引入 1%10%甲醇，以改进分离的选择因子值。除 CO2流体外，可作流动相的还有乙烷、戊烷、氨 、氧化亚氮、二氯二氟甲烷、二乙

6、基醚和四氢呋 喃等。5.检测器在高效液相色谱仪中经常采用的 检测器，如紫外、荧光、火焰光度等 都能在SFC仪中很好应用。但SFC比起 HPLC还具有一个主要优点是可采用 GC中火焰离子化检测器（FID）。我 们知道，FID对一般有机物分析具有较 高的灵敏度，这也就提高了SFC对有 机物测定的灵敏.6超临界流体色谱法与其他色谱法比较（l）与高效液相色谱法比较 实验证明SFC法的柱效一般 比HPLC法要高：当平均线速度为0.6cmS-1时，SFC法的柱效 可为HPLC法的3倍左右，在最小板高下载气线速度是4倍左右 ；因此SFC法的分离时间也比HPLC法短。这是由于流体的低粘 度使其流动速度比HPL

7、C法快，有利于缩短分离时间。（2）与气相色谱法比较 出于流体的扩散系数与粘度介 于气体和液体之间，因此SFC的谱带展宽比GC要小；另外， SFC中流动相的作用类似LC中流动相，流体作流动相不仅载带 溶质移动，而且与溶质会产生相互作用力，参与选择竞争。 还有，如果我们把溶质分子溶解在超临界流体看作类似于挥 发，这样，大分子物质的分压很大，因此可应用比GC低得多 的温度，实现对大分子物质、热不稳定性化合物、高聚物等 的有效分离。 （3）应用范围的比较 图20-s7描绘了 SFC与其他色谱方法测定相对分子质量范围 的比较。由图20-s7看出SFC比起GC法测定 相对分子质量的范围要大出好几个数量级，

8、 基本与LC法相当。当然，尺寸排阻色谱法 （SEC）所测分子质量范围是所有色谱法中 最大的。超临界流体色谱法被广泛应用于天然物、药 物、表面活性剂、高聚物、多聚物、农药、 炸药和火箭推进剂等物质的分离和分析。20-6 毛细管电泳capillary electrophoresis20-1概述早在一百多年以前，较原始的电泳实验，是在一个U 形一管中进行的，管中盛有溶液，两端置有电极，加上 几百伏电压后，首次实验了对毒素和抗毒素的分离。 1909年，L.Michaelis提出“电泳”这一术语，他的实验 是用于测定蛋白质的等电点。此后，许多的研究报告涉 及氨基酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电泳完成了

9、 的溶液中，再次发生对流混合，曾使用了各种稳定介质 ，如琼脂、纤维粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺；为了防 止热扩散而使用了一种内径小的管道，管道内径由3mm缩 小至75m。1981年，Jorgenson和Lukacs 使用75m 内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽。至此， 出现了毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE） 技术。 毛细管电泳，又称高效毛细管电泳（High Performance capillary electrophoresis，HPCE）， 它不同于经典的区带电泳，有如下特点： （1）它是在内径（1O200）m的石英毛细管中进行 的，在毛细管中的

10、散热较好，沿着管截面的温度梯度很 小，因此，可以提高加在毛细管两端的电压，所加电压 可高达几十千伏。（2）它不需要阻流介质，、但可使用凝胶作分子筛介 质。（3）可使用在柱检测法，缩短分析时间，结合计算机 处理数据，可实现自动化操作。（4）灵敏度高，检测眼可达（10-131O-15）mol，使用 激光诱导的荧光检测限可达（1O-191O-21）mol。（5）分辨率高，理论塔板数为几十万至几百万米。（6）取样量少，有时只需几个纳升（nL，10-9L），流 动相只需几毫升。 20-1 高效毛细管由泳的基本原理1.溶质在毛细管区带电泳过程中的传递 含离子的溶液，在电场中所发生的物理过程服从欧姆 定律，

11、当有直流电通过溶液时，阴离子向阳极迁极，阳离子 向阴极迁移，溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移率(又称 淌度，即指溶质在单位时间和单位电场强度下移动的距离)。 离子迁移率以表示，其大小受溶质的电荷离子大小比例所 控制。在电场的影响下，带电荷的质点受到的力Fe，等于其净 电荷q与电场强度E的乘积，即Fe = qE。电场强度E以每单位 长度所加的电压U来表示，即E=U/L，其中L是毛细管长度。 Fe对正电荷为正值，对负电行为负值。电场力促使带电质点 向两极移动，质点在移动过程中，也受到一种与电场力方向 相反的阻滞力Fd，阻止其移动，此阻滞力与质点的电泳速度 成正比，由下式结出Fd =f式中，f是质

12、点平移动所受的摩擦阻力，对小的球状物 质点，可用斯托克斯（Stokes）定律表示，即：f=6r式中，是溶液的粘度，r是离子半径。即摩擦阻力正比 于溶液的粘度、质点大小和其电泳速度。由于存在摩擦 阻力，一种带电质点在电场中运动，被加速到一有限速 度，此速度取决于Fe和Fd，这一有限速度称为电泳速度 ，ep 。当促进力与阻滞力达到平衡时，则ep qEf将上述表达式合并，作为电泳迁移率（或电泳淌度）ep 。表示式，则epepEq士6r 电泳迁移率定义为：一种质点在每单位电场强度下的稳 态速度。ep 值的大小，取决于分子的净电荷数及其摩擦性质， （分子大小和形状）以及所用介质的介电常数和 粘度。因而，

13、对于每一种质点，在电场作用下的 迁移均具有特定的速度。 对于大分子或胶体，其关系可表示为式中，是带电质点的Zeta电位；为溶液的介电常数；K是德 拜一修格尔常数； 为离子半径；参数fK是一个常数；其 值在115之间，取决于迁移质点的形状。HPCE分离，几乎都是在熔融石英毛细 管中完成的，熔融石英是一种高度交联的 SiO2聚合物，具有很好的抗拉强度。石英毛 细管表面含有许多硅酸基：）SiOH，在 一定的条件下可离解。使表面带有负电荷。 由于表面带负电，因此，带负电荷的离子被 表面排斥，而带正电均离子则被毛细管壁吸 引，如图201所示 在毛细管壁的阴离子，与来自主体溶液 中的阳离子在石英一溶液界面

14、上形成双电层 。由于静电场的作用，靠近表面的那些抗衡 离子是不迁移的，因此构成所谓稠密层。由 于热运动关系，离表面远的离子构成可迁移 层或扩散层，因为在双电层内离子的立体分 布，就形成一种电势梯度.当在毛细管两端加有电场时；扩散层内可迁移 的阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因 此，在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道 ，向阴极移动，形成一种液流，称之为电渗流（ electroosmotic flow，EOF），它是一种电泳驱动 力。在双电层内，EOF总是向双电层内抗衡离子 方向迁移，穿过双电层的电势下降的程度受电渗 流速度所控制。电渗流的线速度eo ，可以定义为 ：式中，eo是电渗迁移

15、率，即在单位电场强度下，电渗流的 线速度。 Zeta电势可表示为：=4/ 式中，是毛细管表面电荷密度；为双电层厚度 。按近代电解质理论，等于1K，因此式可 写为：式中，K为德拜一修格尔参数 20-2 在CZE分离中的迁移时间、效 率及分辨率在电渗流存在下，离子的迁移速度可表示为：=（eo）U/Lt式中，Ld是毛细管总长度；U是外加电压。离子的迁 移时间为t，则t=LtLd/（eo）U式中，Lt为进样端到检测器之间的毛细管长度，或 称为迁移长度。分离效率n可表示为式中，D为溶质的平均扩散系数。由上式可见，如果热 影响阿忽略不计的话，增大电压，可增加分离效率。 按Gidding方程5，分辨率R只可

16、定义为式中，是两溶质的区带间的相对速度差。对上面的公 式处理，可得 1和2两溶质的电泳迁移率，而是它们的平均电泳迁移率 。 在许多情况下，电渗流速度比许多 质点的电泳速度要快，因此，在毛细管 中的所有溶质将朝一个方向迁移，不管 它们带多少正电荷，都将先被检出，继 之中性质点被检出，最后带负电荷的质 点被检出。如图202所示。20-3 HPCE仪器的基本结构 HPCE仪器的基本结构如图203所示。充 满缓冲液的毛细管，两端分别浸入盛有缓冲液 的储瓶中，之后通以3OkV的电压，整个带电 管路置于一个安全保护盒内以防高压危险，打 开有机玻璃盒时即自动切断电源。待测组分从 毛细管的一端引人，在电场作用下，由于离子 迁移速度有差别，而在整个毛细管内形成不同 的样品区带，在毛细管的另一端放置检测器， 以便连续地检测流过的每一个组分带，分析信 号通过检狈u器接收后。经放大再输入计算机 系统进行数据处理与储存