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1、第四节 核酸的凝胶电泳 Nucleic Acid Gel ElectrophoresisContent of Table前 言 一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳前 言核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；优点：（1）便于分离;（2）便于检测 ;（3）便于回收： 核酸凝胶电泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状 态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电 极方向迁移；2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质 ，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。 而摩擦系数是分子大小
2、、介质粘度等的函数；因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶 上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核 酸分子。Home一、 琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis（一）凝胶的制备及电泳（二）DNA的迁移速率决定因素1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对 数的常用对数近似成反比；2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状线状 切口环状。4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其 负电荷减少、刚性和长度增加。5 所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压
3、成正比。6 琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；不同类型琼脂糖的性质琼脂糖类型凝结温度/熔化温度/ 标准琼脂糖35389095不同厂家 生产的不 同商品其 凝结温度 和熔化温 度有一定 差异40428590高强度琼脂糖34438595修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖25356365 3565超低熔点8154045低黏性低熔点琼 脂糖253070 3885 3075不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围浓浓 度 （%）标标 准 (kb)高强度 (kb)低熔点 (kb)低黏度低 溶点(kb) 0.3150 0.50.725 0.80.5150.8100.810 1.00.25120.480.4
4、8 1.20.1560.370.37 1.50.0840.240.24 2.00.130.13 3.00.0510.51 4.00.10.5 6.00.010.17 电泳缓冲液常用的有TAE、TPE及TBETAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较都是常用电泳缓冲液。三者相比：1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝 胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE ，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在 T
5、AE中的电泳分辨率要好于TBE。 （二） 凝胶载样缓冲液载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待 电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速 率向阳极迁移。6凝胶载样缓冲液类型6 缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝室温0.25%二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚蓝40.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚蓝440% (m/V)蔗糖水溶液（三）琼脂
6、糖凝胶中DNA的检测通过染色, 紫外灯下检测。主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。1 凝胶的EB染色使用EB染色注意事项（1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸（3）EB使用时的配制、贮存及使用EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 g/ml 。（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。2 凝胶SYBR Gold的染色SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极
7、大增强荧光信号。（四） 凝胶中DNA的成像可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。（五） 凝胶中DNA的回收现一般采用试剂盒回收：存在的主要问题：1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA Home二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原 产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基 聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的 参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三 维带状网格结构。网格孔径的平均直径决定于丙
8、烯酰胺和双功 能交联剂的浓度。（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺）CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2（N，N-亚甲双丙烯酰胺） （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类1 变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链DNA片段的分离或纯化。变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关。用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。2 非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途：制备高纯度的DNA片段。（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰烯酰 胺浓浓 度（%）有效分离范围围 （bp
9、）二甲苯氰氰FF溴酚蓝蓝3.510002000460100 5.08050026065 8.06040016045 12.0402007020 15.0251506015 20.061004512注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; Home三、 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresisPFGE为何选PFGE？超过一定大小的线状双链DNA分子在 琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该 极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎 与分子大小无关，而主要决定于电场强 度。但 PEGE 解决了这一问题。 （一） PFGE 工作的基本原理这种电泳是在
10、两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出 反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应 叫交替电场凝胶电泳。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图（二）PEGE类型 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统(rotating gel) 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field)A-+AB-+B垂直交变电场系统 场翻转系统箝位匀强电场系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+（三） 影响分辨率的因素1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了 可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导 致较小片段泳动的紊乱。3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100 - 1200，研究证实900夹角也非常有效的。4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4 进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。Home
