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1、CAR-TCAR-T基础知识基础知识向莉伟 CAR-T细胞部 2017.07.27导言：CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）药物是一种有生命的药物，原理在于 经嵌合抗原受体修饰的T细胞，可以特异性地识别肿瘤相关抗原， 使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细 胞高，从而发挥抗癌作用。CAR-T细胞疗法在早期的临床试验中并 没有表现出惊人的疗效，然而随着抗CD19 CAR-T细胞疗法在B细胞 恶性肿瘤中显示出的巨大潜力，CAR-T产品一时间成了抗肿瘤领域 的新星。什么是什么是CAR-TCAR-T细胞细胞嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细
2、胞技术；是过继细胞免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy，ACI)的一种；通过基因改造技术，让患者T细胞表达嵌合抗原受体，使效应T细胞的靶向性、杀伤性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态；是一种特异性的免疫细胞抗肿瘤治疗。T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起重要作用， 对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。对T细胞进行基因工程处理，从而在其表面表达能够识别特异性 肿瘤抗原的特殊受体称为嵌合抗原受体（CAR），同时在受体的 胞内段可加上引起T细胞活化的信号传递区域。肿瘤对患者的免疫系统具有抑制作用，限制了自身免疫
3、功能的诱 导和激活，因此可以把患者的免疫细胞放到一种可以避开肿瘤抑 制因素的环境中进行激活和扩增，然后再将扩增后的免疫细胞 回输患者，从而使患者的免疫功能迅速增强，达到杀伤肿 瘤细 胞的作用，这种疗法就是过继性免疫疗法 CAR-T技术原理： 嵌合抗原受体（CARs）是由一个胞外抗原识别域（通常是一个单 链抗体，也可以是多肽或者其他蛋白质）和一个胞内信号域组 成。CAR的胞外部分用来识别特异性的肿瘤抗原，随后胞内信号 域会刺激T细胞增殖，并且通过细胞溶解和细胞因子释放来消除 肿瘤细胞。 第一代CARs的胞内信号域是CD3信号链（signal 1），这一代产品在临床试验中效果有限，可能由于移植T细
4、胞的活化诱导细胞死亡（AICD）或者T细胞扩增的持续性不好所导致。 第二代CARs相比第一代CARs增加了一个胞内共刺激信号域（signal 2）。在过去的5年里，对于第二代含有CD28或者4-1BB(CD137) 共刺激信号域的抗CD19 CAR-T，在治疗B淋巴细胞白血病的临床试验中都表现出优异的疗效，但是仍然需要寻找更好的共刺激信号分子，来解决第二代CAR-T产品作用不持久等问题。 第三代CARs不仅包含CD3信号域，还包括两个共刺激信号分子（图1），这些共刺激信号分子主要包括CD28、4 -1BB以及OX40 (CD134)等，在临床前研究中发现第三代CAR-T细胞疗法效果要优于第二代
5、产品CAR构成（1）-scFV（单链抗体 ）识别肿瘤表面抗原特异性CAR构成（2）- TCR/CD3/产生信号，激活T淋巴细胞有效性CAR构成（3）- co-stimulator 增殖与存活加入CD28，产生IL-2等加入CD137（4-1BB） ， 增强多种能力CD28是T细胞表面的一个蛋白，能够为T细胞提供 共刺激信号，对T细胞的活化和存活具有重要作用。T 细胞刺激信号通过CD28，能够促进多种白介素的分 泌。CD137，又被称作4-1BB、TNFRSF9等，它是TNF受 体家族成员。CD137表达于活化后的T细胞，也表达于 树突细胞，滤泡树突状细胞、NK细胞、粒细胞以及炎 症位置的血管壁
6、细胞等。CD137可以作为共刺激信号激活T细胞，能够增强T 细胞的增殖、存活能力、细胞裂解作用以及IL-2分泌 等。CAR-T细胞的发展过程第一代CAR-T细胞发表时间：1989年；嵌合受体的形成方法： Eshhar研究小组将免疫球蛋白样scFv和FcRI受体(链)或CD3复合物(链)胞内结构域融合形成嵌合受体；激活方式：表达CAR的T细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原, 启动并活化特异性杀伤肿瘤反应；CARs表达的稳定性依赖于所用的胞内信号域；大多数试验在细胞扩增、体内存活时间、细胞因子分泌等方面存在不足，治疗效果不明显。CAR-T细胞的发展过程第二代CAR-T细胞发表时间：20
7、10年；嵌合受体的形成方法：T细胞的完全活化有赖于双信号*和细胞因子的作用。因此，依照T细胞活化的双信号学说, 第二和第三代CARs 在嵌合受体上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatory molecule, CM)，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性, 维持T细胞应答, 延长T细胞存活时间等（图2）； CD28、CD134对提高初始T细胞获得持久的体外增殖和较强的细胞因子分泌非常重要 ；在治疗慢淋中观察到：体内扩增1000倍以上,而且在血液和骨髓中存活的时间也超过6个月, 分泌的细胞因子如干扰素-、CXCL9等较治疗前显著增高。T细
8、胞激活需要双信号 第一信号为特异性 信号, 由TCR识别 抗原递呈细胞表面 的抗原肽-MHC复合 物所启动; 第二信号为协同刺 激信号, 通过 CD28/B7等重要的 共刺激分子, 促进 IL-2合成, 并使T 细胞充分活化及免 于凋亡。CAR-T细胞的发展过程第三代CAR-T细胞 发表时间：2012年； 嵌合受体的形成方法：以逆转录病毒为载体构建第三代CAR-T细胞(scFv CD20-CD28-CD137-CD3）； 两个共刺激因子，进一步提高细胞增殖能力及细胞毒性 患者输注后4小时血液就检测出有高水平的IFN-、GM-CSF、TNF-和IL-6等细胞因子； 效应细胞在体内存活的时间超过1
9、2个月； 由于目前第三代CAR-T细胞临床应用还比较少, 故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T细胞, 以及选择怎样的共刺激分子组合, 还需进一步观察。2nd 病毒载体的转移效率高, 培养T细胞到达临床数量的时间相对较短, 且不同病毒载体具有不同表达特点，故在基础研究和临床试验中应用广泛，是目前主要的基因治疗载体。约70%的治疗方案采用病毒载体。目前最常用的主要是逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体等；非病毒载体有裸DNA、脂质体、多聚物分子耦联体等；近年来,，微环DNA被认为是最好的非病毒载体之一, 在基因治疗中已被广为应用。CAR-TCAR-T细胞临床应用中的问题细胞临床应用中的问
10、题CAR-T细胞的脱靶效应(OFF-TARGET EFFECT)是细胞对设计之外的额外靶点的作用，导致针对正常组织的自身免疫病反应。原因：除了前列腺特异性膜抗原（PSMA），表皮生长因子受体（EGFRv等肿瘤特异性抗原外，大多数靶点是针对肿瘤相关抗原。这些抗原只是重要组织不表达或是损耗组织表达。CAR-T细胞的细胞因子风暴（CYTOKINE STORM）体液中多种细胞因子如TNF-、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-、IFN-、IFN-、MCP-1和IL-8等迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭的重要原因。原因：CAR-T细胞更强的亲和力和信号传导功能使其结合相关抗原
11、后，能大量释放细胞因子，引起炎症反应。CAR-T细胞的插入突变（ INSERTION MUTATION)一个基因的DNA中如果插入一段外源DNA片段，那么其结构便被破坏而导致突变，称为插入突变。原因：CAR-T技术是在T细胞中插入一段外源DNA片段，理论上说其结构已被破坏，存在一定的致瘤风险。CAR-T细胞存在问题的可能解 决办法首先, 很多临床试验采用了剂量爬坡的治疗方法。在同一代次的治疗中, 把细胞剂量由小到大分散到几次回输中, 并不断监测细胞毒性; 或是应用第一或者第二代CAR没有观察到毒性后, 再开始下一代CAR-T细胞的治疗, 防止可能诱发 大规模不良反应。其次, 可以引入自杀基因的
12、人工调控开关, 通过自杀基因系统删除识别靶抗原的剩余CAR-T细胞。第三, 可以把CAR中信号结构域分裂到两个不同CAR(信号一CAR和信号二CAR), 只有当两个CAR与肿瘤表面的靶抗原都结合以后, 才能完全激活应答。第四, 除了激活受体外, 还可以引入抑制性CAR。最后, 还可以根据靶抗原表达水平, 微调CAR亲和性。 小结： 目前来看，CAR-T细胞疗法在血液癌的治疗中已经取得惊人的效果，尤其是 针对B细胞急性淋巴细胞白血病患者的初期缓解率可以达到90%左右。 但是取得显著疗效的CAR-T主要还是集中为靶向CD19的产品，CD19是仅仅表 达在B细胞表面的特异性抗原，利用CAR-T与CD19抗原结合，从而消除B细 胞。通常只能在血液恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤等）中起到良好的治疗效 果。因此，CAR-T研发要取得长远的成功必须解决两个问题：寻找CD19之外 的可以与CAR-T有高度亲和力的抗原靶标，以及将CAR-T的适应症从血液肿瘤 逐步转向实体瘤这个更大的治疗市场。 研究人员也在积极设计开发新型的CAR-T疗法，期望在其他血液肿瘤以及实 体瘤种发挥类似疗效。寻找CD19以外的新型的有潜力的抗原靶标，减少毒副 反应，克服肿瘤微环境中的免疫抑制作用是目前亟需解决的问题谢谢
