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1、实验五 DNA的粗提取与鉴定 一、目的要求: 1. 了解实验原理。2. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法,观 察提取出来的DNA物质。3通过本实验培养实验操作能力和观 察能力。 二、实验原理 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着 NaCl的浓度的变化而改变的。 当NaCl的物质 当量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最 低。利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液 中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的 某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原 理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色 ,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。三、
2、实验材料及用具 鸡血细胞液(510 mL); 95的冷酒精, 0.1 gmL的柠檬酸钠溶 液, 2 molL和0015 molL的NaCl溶 液,二苯胺试剂,蒸馏水; 烧杯(100 mL 1个, 50 mL、500 mL 各2 个),漏斗,试管(20 mL 2个),玻璃棒 ,滴管,量筒(10ml、25ml、50ml、100 mL 、200ml各1个),纱布,镊子,滤纸, 铁架台,铁环,三角架,酒精灯,石棉网 ,试管夹。 四、实验步骤 离心得鸡血细 胞液5 mL 10mL 加蒸馏馏水 50 100mL(10倍) 充分搅拌5 10 min 单层纱布的漏斗 将血细胞液过滤 滤液中加 2 mol/L
3、氯化钠溶液80 150mL 缓缓加入蒸 馏水至粘稠 物不再增加 充分摇 动烧杯 45层纱布(或 单层擦镜纸)的 漏斗过滤钝头镊子将纱布 上的粘稠物夹至20mL 2 mol /L氯氯化钠钠溶液 中 搅拌溶解 两层纱布的 漏斗过滤 加入冷却的体 积为滤液2倍的 95酒精 玻璃棒搅拌 卷起丝状物DNA的鉴定 DNA的鉴定 取两支20 mL的试管 ,各加入浓度为 0.015 molL氯化钠溶液 5 mL,将丝状物放入其中 一支试管中,用玻璃棒搅 拌,使丝状物溶解。然后 ,向两支试管中各加入4mL 的二苯胺试剂。混合均匀 后,将试管置于沸水中加 热 5 min,待试管冷却 后,观察并且比较两支试 管中溶
4、液颜色的变化。 五、注意事项 1制备鸡血细胞液时,要在取新鲜鸡血 的同时加入抗凝剂,使血液分层,取下层 血细胞沉淀。2获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液 加入足量的蒸馏水,以便使细胞膜和核膜 破裂,核内物质释放出来。 3实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱 布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3 次要用其滤液,使用的纱布为12层,第2 次是要用其滤出的黏稠物,使用的纱布为 多层。4实验中有5次搅拌,除最后一次搅拌外 ,前4次搅拌均要朝向一个方向,并且在析 出DNA、DNA再溶解和提取中,各步搅拌都 要轻缓,玻璃棒不要直插烧杯底部,防止 DNA分子断裂。 5实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步,加
5、 水是为了使血细胞吸水膨胀破裂,加水后必须充 分搅拌,不应少于5min,使血细胞充分破裂;第 二次加蒸馏水是在第3步,加水是为了稀释氯化 钠溶液。 6实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中,当 加入氯化钠后,必须充分晃动烧杯,使二者混合 均匀,加速染色质中DNA与蛋白质分离,使DNA充 分游离并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中,加 氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解,不过这时溶 液中蛋白质含量已很少。在步骤8中,加的NaCl 溶液的浓度比前2次低的多,但还是为溶解DNA。 7在步骤7中,必须使用冷酒精(至少在 5以下存放24h),并且将1份含DNA的 NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬 浮在溶
6、液中的DNA丝状物较少,可将混合 液放入冰箱中再冷冻几分钟。 8盛放鸡鸡血细细胞液的容器和实验实验 中的烧烧 杯和试试管最好也是塑料制的,因为为玻璃制 品表面带电带电 荷,DNA中的磷酸基带带相反的 电电荷,会被吸附于玻璃表面,减少DNA含 量。 9本实验成功的关键,是保证提取到 足量且较纯净的DNA。因为DNA在细胞中含 量少,所以在下列步骤中应特别注意:在 步骤1中使用的鸡血的量要在5mL以上。提 取细胞核物质时要充分搅拌5min以上。在 步骤2中要充分晃动烧杯,在步骤3中加蒸 馏水要控制好量,同时应用玻璃棒缓缓搅 动使DNA聚集其上。在第4步中要使用多层 纱布过滤,在第5步中要充分搅拌,在第7 步中使用冷酒精。六、讨论 1提取鸡血中的DNA时,为什么要 除去血液中的上清液?2步骤1和步骤3中都需要 加入蒸馏水,两次加入的作用相同吗 ?为什么? 香蕉DNA的粗提取与鉴定