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1、实验五 DNA的粗提取与鉴定 一、目的要求： 1. 了解实验原理。2. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观 察提取出来的DNA物质。3通过本实验培养实验操作能力和观 察能力。 二、实验原理 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着 NaCl的浓度的变化而改变的。 当NaCl的物质 当量浓度为0.14 molL时，DNA的溶解度最 低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液 中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的 某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原 理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色 ，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。三、
2、实验材料及用具 鸡血细胞液（510 mL）； 95的冷酒精， 0.1 gmL的柠檬酸钠溶 液， 2 molL和0015 molL的NaCl溶 液，二苯胺试剂，蒸馏水； 烧杯（100 mL 1个， 50 mL、500 mL 各2 个），漏斗，试管（20 mL 2个），玻璃棒 ，滴管，量筒（10ml、25ml、50ml、100 mL 、200ml各1个），纱布，镊子，滤纸， 铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网 ，试管夹。 四、实验步骤 离心得鸡血细 胞液5 mL 10mL 加蒸馏馏水 50 100mL（10倍） 充分搅拌5 10 min 单层纱布的漏斗 将血细胞液过滤 滤液中加 2 mol/L
3、氯化钠溶液80 150mL 缓缓加入蒸 馏水至粘稠 物不再增加 充分摇 动烧杯 45层纱布（或 单层擦镜纸）的 漏斗过滤钝头镊子将纱布 上的粘稠物夹至20mL 2 mol /L氯氯化钠钠溶液 中 搅拌溶解 两层纱布的 漏斗过滤 加入冷却的体 积为滤液2倍的 95酒精 玻璃棒搅拌 卷起丝状物DNA的鉴定 DNA的鉴定 取两支20 mL的试管 ，各加入浓度为 0.015 molL氯化钠溶液 5 mL，将丝状物放入其中 一支试管中，用玻璃棒搅 拌，使丝状物溶解。然后 ，向两支试管中各加入4mL 的二苯胺试剂。混合均匀 后，将试管置于沸水中加 热 5 min，待试管冷却 后，观察并且比较两支试 管中溶
4、液颜色的变化。 五、注意事项 1制备鸡血细胞液时，要在取新鲜鸡血 的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层 血细胞沉淀。2获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液 加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜 破裂，核内物质释放出来。 3实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱 布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3 次要用其滤液，使用的纱布为12层，第2 次是要用其滤出的黏稠物，使用的纱布为 多层。4实验中有5次搅拌，除最后一次搅拌外 ，前4次搅拌均要朝向一个方向，并且在析 出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都 要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止 DNA分子断裂。 5实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加
5、 水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充 分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂；第 二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释氯化 钠溶液。 6实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中，当 加入氯化钠后，必须充分晃动烧杯，使二者混合 均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充 分游离并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中，加 氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶 液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl 溶液的浓度比前2次低的多，但还是为溶解DNA。 7在步骤7中，必须使用冷酒精(至少在 5以下存放24h)，并且将1份含DNA的 NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬 浮在溶
6、液中的DNA丝状物较少，可将混合 液放入冰箱中再冷冻几分钟。 8盛放鸡鸡血细细胞液的容器和实验实验 中的烧烧 杯和试试管最好也是塑料制的，因为为玻璃制 品表面带电带电 荷，DNA中的磷酸基带带相反的 电电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含 量。 9本实验成功的关键，是保证提取到 足量且较纯净的DNA。因为DNA在细胞中含 量少，所以在下列步骤中应特别注意：在 步骤1中使用的鸡血的量要在5mL以上。提 取细胞核物质时要充分搅拌5min以上。在 步骤2中要充分晃动烧杯，在步骤3中加蒸 馏水要控制好量，同时应用玻璃棒缓缓搅 动使DNA聚集其上。在第4步中要使用多层 纱布过滤，在第5步中要充分搅拌，在第7 步中使用冷酒精。六、讨论 1提取鸡血中的DNA时，为什么要 除去血液中的上清液？2步骤1和步骤3中都需要 加入蒸馏水，两次加入的作用相同吗 ？为什么？ 香蕉DNA的粗提取与鉴定
