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1、DNA 分子标记在山茶属植物中的应用山茶属（Camellia）是山茶科（ Theaceae ）中种类较多、系统较为原始的属，为雌雄同株、虫媒传粉的常绿灌木或小乔木1，是众多栽培茶花的野生祖先 2。因其植株形态优美、 花姿绰约、 花色鲜艳缤纷、 叶色浓绿光亮而受到世界园艺界的青睐，具有重要的园林应用价值3。山茶是温暖地区重要的观赏树种和经济作物。我国是山茶属植物的分布中心，有着极其丰富的茶花种质资源。早在1000多年前，中国和日本就把一些山茶属原种作为观赏植物进行栽培，并从野生种中选出了许多著名的栽培品种。山茶属约20组280种，分布于东亚北回归线两侧，我国现有 238种，以云南、广东、广西、四
2、川最多 4 。现代人工栽培范围已经遍及我国长江流域以南，北达胶东半岛，在日本、北美、西欧、大洋洲( 澳大利亚、新西兰 ) 等地区也广泛栽培。山茶属植物具有很重要的经济利用价值，其种子含油率高，是重要的食用油和工业用油；茶叶是世界流行的饮料， 是国际贸易的重要商品；有少数种类还可供药用； 大多数种类树形美观， 花朵鲜艳，极具观赏性，是很好的园林绿化树种【7】 。分子标记是继形态学标记、细胞学标记以及生物化学标记之后发展起来的直接反应种质资源遗传物质水平多态性的一种遗传标记，具有标记数量多、 基因组变异丰富、 检测手段方便快捷、 目标基因的表达不受生物的生长发育阶段及外界环境所影响等特点， 是种质
3、资源系统鉴定与育种研究的最高效的手段之一。因此，DNA 分子标记技术在动植物研究中已得到广泛的应用。不同类型的 DNA 分子标记机技术也广泛的应用于山茶的遗传育种研究中，在山茶的进化和系统发育、 种质资源遗传多样性与亲缘关系鉴定、品种指纹图谱和遗传图谱的构建、目标性状基因定位与克隆等研究领域已广泛应用。本文综述了主要几种用于山茶属植物研究的DNA 分子标记技术的基本特点、原理及其应用现状。1 应用于山茶属植物的DNA 分子标记类型1.1 RAPD RAPDRAPD( 随机扩增多态性 ) 标记， 是一种以 PCR 为基础来测定未知物种序列基组多态性的显性分子标记技术。该标记是以基因组DNA 为模
4、板，一个随机核苷酸序列( 一般为 910个碱基对 ) 为引物，进行PCR 扩增，扩增产物的多态性反应其检测物种基因组的多态性。扩增所产生的条带数主要取决于物种基因组的复杂性。RAPD 标记具有可随机合成引物、 无需预知被测物种的基因组的核苷酸序列、方法简便易行、所需模板 DNA 量少、成本低等优点。该技术已广泛的应用于生物的系谱分析、系统进化关系、品种鉴定等的研究上。1.2 AFLP AFLP(扩增片段长度多态性 )标记， 是一种以 PCR技术为基础来扩增物种基因组DNA 限制性片段的一种分子标记技术。该技术是通过引物诱导对基因组DNA 进行选择性扩增来测定物种多态性。 该技术结合了 RAPD
5、 和 RFLP标记技术的优点， 具有所需 DNA 模板量少、重复性好、 多态性好及分辨率高等优点。目前已广泛的应用于动植物的遗传育种、 基因组遗传连锁图谱的构建、 基因表达与调控、 物种的进化与分类中。1.3 SSR ssR(简单重复序列、微卫星 DNA) 标记， 是以一种特异引物 PCR 为基础的显性 DNA分子标记技术。真核生物的基因组中微卫星含量非常丰富，且随机分布在核DNA中，因此，通过对种间或种内微卫星变异数目来测定其多态性，具有多态性高、数量丰富、 信息量高、 特异性强等优点， 目前已广泛的应用于指纹图谱和遗传图谱的构建、目标基因定位等研究中。1.4 ISSR ISSR(简单序列重
6、复间区 ) 标记，是以一种锚定引物(SSR 引物添加碱基 )PCR 为基础的分子标记。该技术是利用锚定引物与特定位点互补的重复序列间的DNA 片段进行 PCR 扩增，其产物的差异性表现为物种间( 内) 的多态性，具有引物通用、多态性高、 信息量大、 检测方便等优点。 目前该技术已广泛应用于植物遗传图谱和指纹图谱的构建、遗传多样性及亲缘关系的研究、物种进化及系统分类研究、品种鉴定等研究中。1.5 EST EST( 表达序列标签 )标记，是指不同组织来源的互补DNA(cDNA) 序列。其表达序列标签代表物种在特定生长发育时期和环境下，特定组织基因所表达的序列，该技术已被广泛的应用于基因组物理图谱的
7、构建、新基因的探寻以及基因识别等研究领域中。1.6 SRAP SRAP( 相关序列扩增多态性 ) 标记，是一种结合了 RAPD 、AFLP 、RFLP 等分子标记优点并克服其缺点的PCR 标记系统的显性新型标记，是通过独特的双引物(17 bp上游引物和 18 bp下游引物 ) 设计对启动子或内含子区域进行特异扩增，其引物具有通用性。 该标记是利用不同种质资源的启动子、内含子与间隔区长度的不同而致使其种间和种内表现出明显的多样性。SRAP 分子标记具有多态性高、 重复性好、易操作、快捷方便、成本低、在基因组中分布均匀、易对特定序列进行测序与相关基因的克隆等诸多优点。 目前已成功应用于构建植物遗传
8、图谱、鉴定遗传多样性及亲缘关系、目标性状定位及相关基因克隆等研究领域。1.7 SNP SNP( 单核苷酸多态性 ) 标记，主要是指单个碱基变异 (转换、缺失、插入) 而引起的DNA 序列多态性。 SNP 具有数量多、分布广泛，快速、规模化筛查，容易估计等位基因频率， 易于基因分型等优点。 多应用于复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等 . 2 DNA 分子标记在山茶研究中的应用2.1 遗传多样性及亲缘关系研究植物遗传多样性一般是指种间或种内的不同个体的遗传差异之和，是物种生存适应与发展进化的基本特征及物种长期进化演变的产物。研究物种的遗传多样性可以了解物种与其生长环境之间的关系，采取
9、科学高效的措施保护物种的遗传资源基因，认识生物多样性的起源与进化，同时也根据资源的DNA 指纹图谱和各个目标性状间的多样性，使其植物种质资源更能合理高效的利用。目前有关山茶种群生物学方面的研究多以朝鲜半岛和日本南部岛屿分布的种群为研究对象。 国内的研究起步相对较晚， 李力等利用同工酶标记对山东青岛长门岩、大管岛和浙江普陀山 2个山茶种群的遗传结构作了分析。施苏华【8-9】等利用RAPD 标记对山茶属金花茶组的 11种植物进行了 DNA 多态性分析，利用 14个引物（10bp）扩增出 201个DNA 片段，用于种间遗传多样性分析，结果表明：小花金花茶与中东金花茶之间亲缘关系较近；大样金花茶、 薄
10、叶金花茶和夏石金花茶之间亲缘关系较近； 龙州金花茶、 毛籽金花茶、 陇瑞金花茶和弄岗金花茶之间关系较近；而凹脉金花茶与其他各种关系相对较远。林立5 等利用简单重复序列扩增（ISSR)分子标记对分布于我国浙江和山东的8个山茶种群共 240个个体进行了遗传结构分析，用 20条引物扩增得到 210条清晰条带，其中 184条为多态性条带，多态位点百分率 (PPB ) 为87.62。经POPGENEI32软件分析， 山茶种群平均多态位点百分率 ( PPB )为68.99 。Neis基因多样性指数 (HE) 为0.2569，Shannon 信息指数 ( H)为0.3779，种群遗传多样性较高。基因分化系数
11、Gst=0.1829，表明遗传变异主要存在于种 群内个 体 间。地 理距离与遗传距离 具有显著相关性(r=0.8567 ，PO.05)。说明岛屿地理隔离对山茶种群的遗传分化具有重要影响。UPGMA聚类表明：浙江5个山茶种群间的遗传相似度较高。山东青岛的植物园种群和五四广场种群可能移植自长门岩岛。建议我国野生山茶资源受人为破坏严重，建议在加强现有岛屿自然种群就地保护力度的同时，建立山茶种质资源库， 促进基因交流 6 。罗晓莹【 11】等运用 ISSR分子标记对珍稀濒危植物杜鹃红山茶(Camellia changii Ye)2个亚种群 60个单株的遗传多样性进行了研究，结果表明：物种水平上的多态位
12、点百分率（PPB ）为55.29%,Nei s基因多样性指数（ H）及Shannon多态性指数 （I ）分别为 0.2191和0.3215。揭示了杜鹃红删除的遗传多样性较低，亚种群件遗传分化较小。小种群和人为活动干扰是杜鹃红山茶濒危的主要因素。作为一种重要的经济作为， 茶树遗传多样性研究是其重要内容。近年来，RAPD标记技术大量应用于茶树遗传育种与亲缘关系鉴定以及遗传多样性方面的研究。Wachira利用RAPD 标记对茶树无性系的遗传多样性和分类关系进行研究，将38个无性系分为 3个类群，其中类群间存在70% 的遗传变异，而类群内遗传变异仅为30% 。 （11）2.2 物种鉴定与系统分类分子标
13、记技术能有效地确定山茶属植物种质资源间的物种鉴定及系统分类研究，提高山茶属植物的育种效率。通过对基因结构和组成的了解，为植物分类提供最客观的判断标准。邓白罗等【10】对山茶属 29种红山茶组植物进行了RAPD分析，用UPGMA法进行聚类， 结果表明： 可以将山茶属红山茶组的 29个种划分为 4大类，其结果进一步验证了张宏达的分类系统。参考文献：1 张宏达，任善湘.中国植物志：第四十九卷第三分册 M. 北京：科学出版社，1998:84 2 高继银，陈绍山，徐碧玉.世界著名茶花M. 杭州：浙江科学技术出版社，1998 3 高继银，苏玉华，胡羡聪. 国内外茶花名种识别与欣赏。杭州：浙江科学技术出版社
14、，2007 4 张常乐，丁绍刚，李升科 . 山茶属植物在园林绿化中的应用. 江苏农业科学， 2011,39 （6） ：314-316 5 林立，李纪元、倪穗等，岛屿地理隔离对山茶种群遗传结构的影响，林业科学研究， 2012,25（3） ：378-384 6 林立，倪穗，李纪元等. 中日5个岛屿山茶种群遗传多样性研究. 广西植物，2012,32（3） ：298-303 7 罗春清，谭晓风，漆龙霖 . 山茶属植物分类综述 . 中南林学院学报， 1999,19（3） ：78-81 8 施苏华，唐绍华，陈月琴，11种金花茶植物的RAPD 分析及系统学意义，植物分类学报， 1998,36（4） ：317-322 9 唐绍清，施苏华，林海波。几种因素对山茶属植物RAPD 分析的 DNA 扩增的影响。广西植物， 1998,18（20:185-188 10 邓白罗，谭晓风，漆龙霖等。山茶属红山茶组植物的RAPD 分析及分类研究。林业科学， 2006,42（5） ：36- 【11】罗晓莹，庄雪影，杨跃生. 杜鹃红山茶遗传多样性的ISSR分析. 热带亚热带植物学报， 2007,15（2） ：93-100
