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1、实验五 氨基转换作用目的要求：了解转氨酶在代谢过程中的重要作用学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应实验原理体内-氨基酸的-氨基在氨基转换酶的作 用下，移换至-酮酸的过程，称氨基转换作 用。转氨酶 (aminotransferase) v 转换酶中的一类。催化氨基酸和a-酮酸 或醛酸之间的氨基转换反应，生成与原来的 a-酮酸或醛酸相应的a-氨基酸或- 氨基酸 ，原来氨基酸转变成相应的酮酸。转氨酶催 化的反应都是可逆的 v转氨酶参与氨基酸的分解和合成，是人体代谢过 程中必不可少的“催化剂”；v以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最 为重要。vGPT 主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中，在肝脏 中活
2、力最大。GPT升高是肝脏功能出现问题的一 个重要指标。 本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中 谷氨酸丙酮酸氨基转换酶（简称谷丙转 氨酶）的作用下进行氨基转化反应，然后用 纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。谷丙转氨酶L谷氨酸丙酮酸-酮戊二酸L丙氨酸由于谷氨酸、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基转换过程的观察，因此在反应体系中添加溴乙酸以 抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。试剂和器材试剂 1%谷氨酸（中性）；1%丙酮酸钠（ 中性）；0.1%KHCO3；0.025 溴 醋酸（中性）；2% 醋酸；0.1%标 准谷氨酸；0.1%标准丙氨酸。 展开剂：酚饱和水溶液：2份酚加1 份水混合放
3、入分液漏斗，振荡。静 置24hr后分层，取下层酚置瓶中备 用；通风橱里 显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。 材料肌肉糜：取兔子肌肉1g，置 研钵中，加0.9% 氯化钠溶 液3ml，在低温下研磨成细 浆，离心5分钟（3000转/分 ），弃去沉淀，得肌肉糜提 取液。 操作方法v一、转氨酶作用 1、取试管2只编号（1、2），向每个试管各加0.5mL 1%谷 氨酸溶液,0.5mL 1%丙酮酸溶液,0.5mL 0.1% KHCO3和 0.25mL 0.025%溴醋酸, 混匀。然后分别加入肌肉糜提取 液0.5ml，混匀，将其中一试管立即在沸水浴中加热2-3分 钟做对照。用试管帽塞住另一只试管置于45水浴中
4、保温40 min。2. 保温完毕，取出试管。向每只试管中各加2% HAc溶液4滴 ，再置于沸水浴中2min，使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤 液或取1毫升在EP管中高速离心1分钟二、层析验证v1. 取小培养皿一个，加入酚饱和水溶液约0.5cm高，取 圆形滤纸一张，在中心剪一直径1-2mm的小孔，并以圆心 约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上，用铅笔点四 个等距离的原点并表明1，2，3，4。12342.点样用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨 酸、标准丙氨酸，依次点在标明号码的原点处， 以吹风机吹干，再重新点样2次。注意斑点不能太 大，一般直径约2mm为宜。3.另取一条滤纸卷成实心筒状，直径约
5、2mm,将此小筒插 入滤纸中心小孔（不可突出纸面之上），使层析滤纸通过 此小筒与酚溶液相连。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养 皿上。另取一培养皿盖在滤纸上，此时酚溶液即由滤纸中 心孔向四周扩散。 v4. 当酚溶液扩展到直径约7-8cm时，取出滤纸。 用铅笔画下酚溶液扩展边缘，用吹风机吹干。用 喷雾器喷以0.1%茚三酮溶液，再用热风吹干。用 铅笔圈下各显色点。测定各显色点的Rf 值，并解 释之。v注意: 当温度、滤纸质量和展开剂等都相同时，对 于一个化合物比移值Rf是一个特有的常数 。三、计算公式Rf原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离 1. 什么叫转氨作用？2. 根据所学理论阐明转氨作用在
6、蛋白质的合成与分解及糖、 脂肪代谢中有何作用？思考题重 要 通 知第十周的蛋白质分离纯化大实验安排在周末进行，第九 周周末开始。实验时间08：3017：00，中午可以轮 换去吃午餐。实验具体日期及班级安排如下：v11月14日 周二晚上做实验的所有同学。104人v11月15日 周四晚上做实验的所有同学。100人v11月21日 周五下午做实验的所有同学。98人v11月22日 周一下午B类（2）实验的所有同学。88人备注：1.如最后一次实验的同学，本次实验报告隔一周 后由班长 代收，集中送到生物楼4316室。2.B类（2）实验同学的课程，第11周恢复正常上 课时间，即11月23日进行质粒DNA的抽提实验（实验 52）。
