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1、实验专题模块一 血糖和血糖的 调节 血清葡萄糖测定 糖化血清蛋白（果糖胺）测定生化实验室守则请同学们仔细阅读生化实验室守 则，并注意遵守。微量移液器的使用 1.选择合适的移液器。 2.吸头安装。 3.容量设定。 4.预洗吸头：在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需 要转移的液体吸取、排放两到三次。 5.吸液：先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直进入液面 ，浸入的深度为：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于 或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米，P5ml、P10ml小于或等于4毫米，平稳松开按钮，切记不能过快。 6.放液：放液时，吸头紧贴容器壁，先将
2、移液器排放按钮按至第一停 点，略做停顿后，再按至第二停点。 7.卸去吸头：用过的吸头如果不用了，可以用拇指按住移液器顶端的 另一个按钮，把枪头打掉。 8.移液器容量复原：使用完毕，把枪调到最大量程，这样有利于枪的 保养。p糖尿病是由于胰岛素分泌不足或/和胰岛素作用低下而引起的代谢紊乱综合征，高血糖是其最主要特征。根据病因，糖尿病可分为不同类 型，主要包括1型、2型、其他特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病等。 p最近30年我国糖尿病患病率急速增长，约增长了15倍, 成为世界第一 糖尿病大国。中国最新流行病学调查显示，2型糖尿病在成年人高度 流行，年龄标化的总糖尿病患病率为9.7%。 p正常血糖是空腹静
3、脉血浆葡萄糖7.00mmol/L和餐后2小时血糖11.10mmol/L即为糖尿病。 p糖化血清蛋白（果糖胺）测定可反映糖尿病患者抽血前2-3周内血糖 总的水平，亦为糖尿病病人近期监测指标，正常值为1.72.8mmol/L。 pHbA1c测定可反映糖尿病患者抽血前812周的血糖控制情况，病情 控制不良的糖尿病病人其HbA1c较正常人高，且与病情控制不良程度 相关，正常值为6.5%。 p血浆胰岛素和C肽测定有助于了解胰岛B细胞功能和指导治疗，空腹 血浆胰岛素正常值为515mU/L，正常人血浆基础C肽水平300 600pmol/L。 糖尿病实验一 血清葡萄糖测定 一、实验目的 1. 掌握血糖的基本知
4、识及空腹血糖、餐后血 糖检测在糖尿病诊疗中的应用。 2. 掌握葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖浓度 的原理与操作过程。 二、背景与原理 （一）背景 应用酶学方法测定血液葡萄糖是临床化学中的主流方法。最常用的酶学方法有葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。其特点是具有较高的灵敏度 、准确度和精密度，使用温和的反应条件，操作简单方便，适用于自动 分析仪。 己糖激酶法：第一步是在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP发生磷酸化反应 ，生成葡萄糖-6-磷酸；第二步是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下，葡萄糖- 6-磷酸和NAD或NADP发生氧化还原反应，生成6-磷酸葡萄糖酸和NADH或 NADPH。在波长340nm处，监测吸光
5、度的增高。吸光度的净增高值与葡萄糖浓度成正比。己糖激酶方法和葡萄糖氧化酶方法相比对葡萄糖的特 异性更高，不受尿酸和抗坏血酸的干扰，特别适用于急诊检验使用。 葡萄糖氧化酶：本法分极谱分析法和比色法两类。但二者的初 反应都是在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸 ，同时消耗溶液中的氧，产生过氧化氢。极谱分析法是用氧电 极监测溶液中氧的消耗量，氧的消耗量与葡萄糖浓度成正比。 比色分析法是用葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的偶联反应系 统。初始反应中过氧化氢的生成量与葡萄糖浓度成正比。在辣 根过氧化物酶进行比色测定。该法的缺点是易受还原性物质如 胆红素、抗坏血酸和尿素等干扰，但准确度与精密度都能达
6、到 临床要求，操作简便，是目前临床推荐常规检验的方法。 （二）原理 1.葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸（D-葡 萄糖酸-内酯），并产生一分子过氧化氢。2.在色原性受体（4-氨基安替比林偶氮酚）的存在下，过氧 化物酶（POD）可将过氧化氢分解为水和氧，并使4-氨基 安替比林和酚去氢缩 合成红色醌亚 胺，即Trinder反应。 红色的醌类 化合物生成量与葡萄糖含量成正比。其反应如下：2葡萄糖 + 2H2O+O2 2葡萄糖酸+ 2H2O22H2O2 + 4-氨基安替比林+酚 醌亚胺+ 4H2O醌亚 胺在480550nm波长有最大吸收，与同样处 理的标准液 比较，经计 算可求出血浆葡萄
7、糖含量。GODPOD四、 实验操作 1. 准备健康成年家兔三只（每个实验班），常规饲养 。 2. 将三只家兔固定在兔盒上，割破耳沿静脉并留取对 照血液1-2ml，凝固后分离出血清备用【血清分离： 待凝固后（约20-30分钟），30005000rpm，离心5 10分钟，将上清转移至另一离心管中】。3.按2U/kg体重给第一只兔子注射胰岛素，然后用采血 管分别在注射后45分钟和90分钟等时间点，割破家兔 耳朵血管，留取家兔血液各1-2ml，分离出血清后备 用。4.按0.4ml/kg体重给第二只兔子注射0.1%的肾上腺素 ，然后用采血管分别在注射后30分钟和60分钟等时间 点，割破家兔耳朵血管，留取
8、家兔血液各1-2ml，分 离出血清后备用。 5. 第三只兔子的处理：先按2U/kg体重给兔子注射胰岛素， 45分钟后割破家兔耳朵血管，留取血液1-2ml；马上按 0.4ml/kg体重给予注射0.1%的肾上腺素，30分钟后留取血液1- 2ml。以上血液均分离出血清备用。（以下实验中，整个实验 班以6人/组分组，在各个组中，每两个人负责一只兔子的样品检测）。 6. 氧化酶法测定血糖：取试管，做好标注后，按下表进行操 作： 加入物 (ml) 测测定管 标标准管空白管 血清（以上各 实验组获 得） 0.0200葡萄糖标准应 用液 00.020蒸馏水000.02酶酚混合试剂 2.02.02.0混匀后，置
9、于37水浴箱中，恒温水浴15分钟。然 后用722型分光光度计，波长505nm，以空白管调零 ，分别读取标准管和测定管吸光度，并按以下公式 计算结果：血清葡萄糖（mmol/L）=（测定管吸光度/标准管吸 光度） 标准液浓度 7. 并将所测得的结果记录在实验记录本上，每只兔 子的实验数据处理完后，以时间为横坐标，血糖浓 度为纵坐标作曲线图。分析胰岛素和肾上腺素对血 糖的影响。 实验二 糖化血清蛋白（果糖胺）测定一、实验目的 1. 掌握糖化血清蛋白（果糖胺）检测在糖尿病诊疗中的应用。 2. 了解NBT底物法检测糖化血清蛋白（果糖胺）的原理与操作。 二、背景与原理 （一）背景糖化血清蛋白（果糖胺）是血
10、清蛋白质与葡萄糖非酶糖化过程中形成的高分子酮胺结构，类似果糖胺的物质，又被称为血清果糖胺。其生成量与血糖浓度相关，并相对保持稳定，它的测定结果的高低却不受抽血时血糖浓度的影响。由于人血清果糖胺的代谢周期与血清蛋白相同，半衰期为1720天，在23周内发生代谢变化，故果糖胺可以反映糖尿病患者检测前23周内的平均血糖水平，是评价糖尿病控制情况的一个良好指标，尤其是对血糖波动较大的脆性糖尿病及妊娠糖尿病，了解其平均血糖水平有实际意义。血清果糖胺正常值为1.642.64mmol/L，血浆中果糖胺较血清低0.3mmol/L。 （二）原理血清葡萄糖能与白蛋白及其他血清蛋白分子N-末端的氨基发生非酶促糖化反应
11、，形成高分子酮胺结构。此酮胺结构能在碱性环境中与硝基四氮唑蓝（NBT）发生还原反应，生成有色物质甲撍，与1-脱氧-1-吗啉果糖（DMF）为标准参照物进行比色测定，颜色深浅与血糖浓度成正比。 NBT底物法检测糖化血清蛋白（果糖胺）操作步骤 加入物(ml) 样品管 校准品管 空白管血清 0.05 标准品 0.05 蒸馏水 0.05 试剂 1.0 1.0 1.0 1.混匀，立即在分光光度计上进行检测（先用空白管在波长 540nm处调零），并启动计时表。2.三分种后，记录起始吸光度，然后每隔一分钟记录一次，共三分钟（为什么？）。3.计算出平均A/min。4.计算:果糖胺的含量= （A/min 样品/ A/min 校准品）校准品浓度课堂分组讨论我学院负责卫生的王阿姨今年48岁，平时体健 。近半年来不明原因消瘦，饭量变大，同时睡到半 夜常常感到口干，需要起来喝水，尿量也有不同程 度增多，并且尿中有很多泡沫，觉得体力也不如以 前。近一个月来在工作过程中不小心弄破手、足皮 肤时常出现感染不易愈合，看东西也没有以前清楚 ，感觉模糊（还总是怀疑是否老花眼）。（1）如果你是王阿姨的接诊医生，根据王阿姨的 情况，你会建议做什么检查？（2）如果王阿姨确诊是型糖尿病，请你分析为什 么会出现伤口易感染不易愈合、看东西模糊不清。
