微生物的生长及控制

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1、第六章 微生物的生长及其 控制生物个体由小到大的增长，即表现 为细胞组分与结构在量方面的增加 生长指生物个体数目的增加 繁殖在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而 且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难 以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物 生长的指标。个体生长个体繁殖群体生长群体生长个体生长个体繁殖在微生物的研究和应用中，只有群体 的生长才有实际意义。 微生物的生长繁殖是其在内外各种环 境因素相互作用下的综合反映。 群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖 交替进行的过程，称之为发育。第一节 测定生长繁殖的方 法微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细 胞群繁殖得到的后代称为

2、纯培养。一、纯培养的分离方法（一）、稀释法 l 液体稀释法 l 固体稀释倒平板法稀释倒平板法 （二）、平板划线分离法 用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无 菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连 续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经 培养后，可在平板表面得到单菌落。 （三）、单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞 或单个个体进行培养以获得纯培养 。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑 取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细 管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然 后移到合适的培养基进行培养。 （四）、选择性培养基分离法

3、各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有 不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生 物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养 微生物以获得纯培养。 微生物纯培养分离方法的比较分离方法应用范围平皿划线法方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊 的二、微生物生长繁殖的测定测定微生物生长的方法根据：生长意味着原生质含量的增加（一）测生长量1、直接法 l测体积 l称干重：1mg干菌体=5-10mg湿菌体=5-10107个菌体 2、间接法 l比浊法 l生理指标法 比浊法生理指标测定

4、法常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活 性、生物热等与其群体的规模成正相关。与微生物生长量相平行的生理指标：含氮量、含 碳量、几丁质含量、DNA、RNA等等蛋白质总量=含N量%6.25(二)计繁殖数 即计算微生物的个体数目计繁殖数只适宜于单细胞状态的微生 物或丝状微生物所产生的孢子 1、直接法 所得的结果是包括死细胞在内的总菌数 a、涂片染色法原菌液含菌数/mL = 视野中平均菌数视野个数/cm2 100 稀释倍数b、比例计数法c、血球计数板利用血球 计数板， 在显微镜 下计算一 定容积里 样品中微 生物的数 量。 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动

5、细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察。原菌液含菌数/mL = 每小 格平均数40010000 稀释倍数2、间接法原理是每个活细菌在适宜的培养基和 良好的生长条件下可以通过生长形成菌落 。所测的菌落就是待测样品所含的活菌 数。平板菌落计数法 优点：u适用于多种材料；u菌数较少也能准确测定。缺点：u并非所有微生物在试验期间都能长出菌落；u意外的损伤可能导致菌落减少；u肉眼无法观察的菌落。活菌指示剂：TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）厌氧的菌落计数法l亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技 术、气体喷射培养法 l厌氧手套箱培养法用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正

6、常菌群 ）的研究工作 l厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法 不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌 的检验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧 病原菌。 一、同步培养 概念：同步培养(synchronous culture) 是一种培养 方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行 生长或分裂的群体细胞。 同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生 长阶段，并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的 生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种 理想的材料。第二节 微生物的生长规律同步培养方法 机械方法环境条件诱导法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法

7、温度培养基成份控制最高稳定期的细胞接种硝 酸 纤 维 素 滤 膜 法离 心 法机械法： l 优点：不影响细菌代谢； l 缺点：不能用于即使是相同发育阶段个体大小不 一致的微生物。诱导法： l 优点：方法多、应用范围广； l 缺点：对细菌代谢有影响。将少量单细胞的纯培养物接 种于一恒定容积的新鲜培养基中 在合适条件下进行培养，在不补 充营养物质或移去培养物，保持 整个培养液体积不变条件下，以 时间为横坐标，以菌数为纵坐标 ，根据不同培养时间时细菌数量 的变化，可以作出一条反映细菌 在整个培养期间菌数变化规律的 曲线。生长曲线二、单细胞微生物的典型生长曲线 生长曲线可分：延滞期对数期 衰亡期 稳定

8、期 （一）延滞期（lagphase） 特点：生长速率常数等于零；细胞形态变大或增长；细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性 ； 合成代谢活跃；对外界不良条件反应敏感。 将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内 菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也 称延迟期、适应期、调整期。延滞期的出现，可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物 的酶、辅酶或是缺乏充足的中间代谢物。为产生 诱导酶或合成有关的中间代谢物，就需要有一段 适应期，于是出现了生长的延滞期。 出现延滞期的原因？影响延滞期长短的因素 菌种接种龄 接种量 培养基成分 在工业发酵和科研中通常

9、采取一定的 措施缩短延滞期：l通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；l利用对数生长期的细胞作为“种子”；l尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；l适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响 。（二）指数期（exponentialphase ） 又称为对数期，是指生长曲线中紧接延滞期的 一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。特点：生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需 的代时G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短 ；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；酶系活跃，代谢旺盛。繁殖代数（n） 繁殖代数 n=3.322 ( lgx2lgx1)1 2=21 2 4=22 4 8=

10、23 8 16=24 16= 124 2nx2= x1 2n lg x2 = lg x1 + n lg2 n = （lg x2 lg x1） / lg2 =3.322 ( lg x2 lg x1 )生长速率常数（R）代时（G） 例：设大肠杆菌在接种时的细胞浓度为100 个/mL，经过400min的培养细胞浓度增至 10亿个/mL，求该菌的繁殖代数和世代时 间。解：n = 3.322 ( lg x 2 lg x1 )= 3.322 ( lg 109 lg102)=23.2G=1/R= ( t1 t2 )/ 3.322 ( lg x 2 lg x1 )= 17.3影响指数期微生物代时的因素菌种营养

11、成分 营养物浓度 培养温度 凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量 的某营养物称为生长因子。大肠杆菌： 12.5-17min枯草芽孢杆菌： 26-32min嗜热乳杆菌： 66-87min结核分枝杆菌： 792-932min梅毒密螺旋体： 1980min大肠杆菌： 牛奶 12.5min肉汤 17min产气肠杆菌： 肉汤或牛奶 16-18min组合 29-44min乳酸链球菌： 牛奶 26min乳糖肉汤 48min对数生长期的细菌个体形态、化学组成和 生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、 代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好 材料，也是增殖噬菌体的最适宿主。对数生长期的细菌常在生产上

12、用作种子， 使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。（三）稳定期（stationaryphase ） 特点 生长速率常数R等于0 菌体产量达到了最高点 菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例 关系，即，生长产量常数Y 又称为恒定期或者最高生长期。稳定期到来的原因营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，例如CN比值不合适等；酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。稳定期的细胞行为细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生 代谢产物； 是乳酸等发酵生产的最佳收获期。

13、获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：补充营养物质或取走代谢产物或改善培养 条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等。 （四）衰亡期（declinephase或deathphase ） 个体死亡的速度超过新生的速度，因此 ，整个群体就呈现出负生长（R为负值）现象：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶， 产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外 肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生 畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性 菌变成阴性反应等。特点： l细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态；l有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶 （autolysis）；l有的微生物在这

14、时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物；l在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期三、微生物的连续培养 连续培养：又称开放培养，当微生物以单批培养的方式培养 到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和 通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式 ，以同样的流速不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达 到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状 态和衡定的生长速率上，就形成了连续生长。连续培养器 连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以 同样的速率移出培养物。恒浊器（turbidostat） 控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长 速

15、度恒定的微生物细胞的连续培养器，可达到恒 密度的目的，使微生物在最高生长速率下生长。为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某 些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器 。通过连 续培养 装置中 的光电 系统控 制培养 液中菌 体浓度 恒定、 使细菌 生长连 续进行 的一种 培养方 式。 用于菌 体以及 与菌体 生长平 行的代 谢产物 生产的 发酵工 业恒化器（chemostat） 一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始 终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种 连续培养装置,又称为恒组成连续培养。 通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生 长限制因子，控制生长速率；可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低 于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。 生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机 盐，生长因子等物质。 恒化器连续培养通常用于微生物学的研究工作：l 从遗传学角度，允许作长时间的细菌培养而从中分 离不同的变种；l 从生理学角度，能观察细菌在不同生活条件下的变 化；l 从生态学角度，也是研究自然条件下微生物生态体 系比较理想的实验模型。恒化器与恒浊器的比较 单级连续培养器如果某微生物代谢产物的产生速率与菌体生 长速率相平行，就可以采用单级恒浊器来进行研