《分子标记及其在植物遗传育种中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子标记及其在植物遗传育种中的应用（115页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子标记及其在植 物遗传育种中的应 用遗传标记（genetic marker）具有多型性易于鉴别与目标基因紧密连锁 性状标记色泽， 形态 细胞学标记倒位，易位，G/N/C带 生化标记同功酶 分子标记RFLP、RAPD、SSR、AFLP 、SNP 基础基础- - 基因表达基因表达 结果结果 表现型表现型DNADNA碱基碱基 序列变异序列变异形态标 记n遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。l如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等 。v特点：直观简单l从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育 等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。 细胞学标 记n染
2、色体数目变异及结构变异，表现在染色体 核型（数目、大小、随体、着丝点位置等） 和带型（C带、N带、G带等）。l随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展 ，可在染色体水平揭示更多遗传变异。v特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。 生化标记贮藏蛋白和同工 酶n贮藏蛋白同工酶v特点：经济、方便、成本较低v结构基因表达产物，对非结构基因无能 为力；所检测位点只是基因组一部分； 数量有限，有时受发育时期和环境影响 。分子标 记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）不受季节、环境、基因表达与否的限制 ； （2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性
3、遍及整个基因组；（4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达 ，与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合 杂合基因型，提供完整的信息。分子标记的分类（Staub等1996 ）分 子 标 记以Southern为基础如RFLP以PCR为基础单引物PCR标记 有RAPD、 AP-PCR、DAF、ISSR等双引物选择性扩增PCR 主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记如SSR、STS等植物遗传研究中常用的分子标 记nRFLP Restriction Fragment Length Polymorphism nRAPDRandom Amplified Polymorp
4、hic DNAs (DAF, AP-PCR)nSSR Simple Sequence RepeatnAFLP Amplified Fragment Length PolymorphismRFLPn原理： DNA限制性内切酶酶切电泳转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小n酶切：3-5ug DNA，以10U内切酶酶切5小 时 n电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时 n染色：EtBr染色20分钟 n变性：0.25M HCl 20分钟，抽真空，水冼n印迹：加入0.4N NaOH，进行Southern 印 迹n冲洗：以2SSC 冼胶，风
5、干酶切电泳印迹杂交洗脱n预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5 HSB、Denhardt）中， 封好后置65温 箱中振荡56小时。n杂交：预杂交液中加入标记好的marker和 探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置 65温箱中振荡过夜。n洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65 振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。放射自显影n将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室 中将 X-光片放于杂交膜上， 再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置- 70超低温冰箱中曝光10天左右。n使用磷屏仪，操作更方便。RFLP探针n来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针ncDNA探针:保守性较强，探针
6、检测的多态性频 率较低。ngDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种 属特异性较强。n玉米RFLP探针： http:/www.maizegdb.org/probes. Html探针标记随机引物法n25 ng变性DNA n5ul 寡聚核苷酸n2ul BSAn3ul -32PdCTP n2ul Klenow酶n加水至50ul，37温箱中标记2小时RFLP标记特点l 共显性，可以区别纯合和杂合基因型 l 稳定、重复性强 l 某些植物中开发探针已遍及整个基因组 l 缺点：DNA需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多 态性很低，使遗传图饱和度低。RA
7、PDn原理：用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点 地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。Polymerase Chain Reaction-PCR3553Target DNA sequenceGCTCGCAGTACT TCATGACGAGCGdenature 95 C5335GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGA GCTCGCanneal primers 60 CTaq polymerase binds 3 and extendsGCTCGC5335AGTACTTCATGACGAGCGTCATGA GCTCGCDNA is doubled
8、 with each cycleRepeat 25-40 timesRAPD的操作PCR反应：DNA（20ng/l）1lPrimer15ng10Buffer2.0lMg2+（25mM）1.2lTaq酶（5U/l）0.15ldNTP（25mM）0.2l加水至20l，再加入石腊油，进行PCR扩增Step1 95 2分钟Step2 95 15秒 Step3 36 30秒 Step4 72 45秒 Step5 GOTO Step2 46循环 Step6 72 5分钟 PCR扩增：主要特点无需杂交，设计引物也无须知道序列信息 ；DNA需要量少，引物便宜，成本较低；技术简便，操作方便、快速，不涉及分子 杂
9、交和放射性自显影等技术。不同物种间引物通用； v缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯 合子；实验重复性较差，结果可靠性较低 。DAF (DNA amplification fingerprinting) ： 与RAPD不同的是: 引物浓度更高，引物长度更短（一般58 个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电 泳，通常会产生非常复杂的带型，谱带 信息比RAPDs大得多。（Caetano-Anolles等，1990）AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)l引物较长（1050bp）； l引物浓度较高； l引物长度不定，并且常常来自为其 它目
10、的而设计的引物（如M13通用测 序引物）。ISSRl共同优点：在不需要知道所扩增DNA序列情况下 ，产生DNA片段的指纹；需DNA量少，产生多态性丰富。l缺点：l 对反应条件非常敏感，重复性差。SCARs （Sequenced Characterized Amplified Regions ）n为提高RAPD标记稳定性，把目标RAPD片段克隆测序，根据片段两末端的序列设计 特定引物（通常24个碱基），再进行PCR扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。v具有更高的可重复性v共显性微卫星标记 (SSR)l真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大 约每隔10-50kb就存在一个SSR. l哺乳动物中约为植
11、物的5-6倍;植物中平均 23.3kb有一个SSR;双子叶植物SSR数量大于 单子叶植物,核DNA SSR数量多于细胞质 DNA; l根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基 、2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。l不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 l通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器 DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现：l(AT)最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、 (CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、 (AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、 (TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT
12、)n及(AC)n、(GT)n。 l同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大 。SSR的分布特点SSR的功能n长期以来一直认为SSR是转录哑区，没有明确 的生理功能。但随着研究深入，证明并非如此 。nSSR的主要功能: 编码氨基酸；染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降 解、融合及丢失的功能；提高或降低临近基因转录速率；基因重组的热点，是基因变异的来源；部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体v两端序列多是保守的单拷贝序列， 可以根据两端序列设计一对特异引 物，通过PCR将其间微卫星序列扩增 出来，利用电泳技术获得长度多态 性。v不同材料重复次数的不同，导致了 SSR长度的高度变异性
13、。SSR分析SSR分子标记的创制基因组文库的构建探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择测序引物设计检测其它方法: EST-SSR、相关种间SSR. .Cross-species SSRTaxonomic Transferability PolymorphismDivergence % (N) % (N)Same subgenus 89.8 (521)78.3 (299) Same genus 76.4 (1800) 86.0 (773) Same alliance 45.4 (403)50.4 (141) Same family 35.2 (1683) 58.4 (363)SSR的操作PCR反
14、应： DNA（20ng/l）4lPrimer（1mM）0.25l10Buffer2.0l Mg2+（25mM）1.2l Taq酶（5U/l）0.1l dNTP（25mM）0.2l 加水至20l混合后，进行PCR扩增：Step1 95 2分钟Step2 95 30秒Step3 56 30秒Step4 72 60秒Step5 GOTO Step2 31循环注：SSR引物退火温度在52-65 不等。SSR的特点 ：l两侧顺序保守，在同种间多相同；l数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；l实验重复性好，结果可靠；l多数SSR增减重复序列频率高，在品种间 具广泛位点变异；l共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子
15、；l仅需微量组织，适合PCR分析半自动化v相对的物种专一性；v由于开发时需针对每个座位的微卫星序列 ，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需 建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等 过程，开发困难，费用较高，耗时长；v实际分析时一般每次只分析单个位点；v不同引物退火温度不同，需要探索。不足：SSR的检测u琼脂糖凝胶检测（同前）u聚丙烯酰胺凝胶检测u一般采用银染、荧光检测。银染检测程序脱色：加1升10%HAC液，脱色20分钟冲洗：用重蒸水冲洗胶板2次，每次5分钟染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分钟冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过5秒钟；显影：预冷显影液（30g/LNaCO3，0.07
16、5%甲 醛，0.4mg/mlNa2SO3），轻摇到带纹出现；定影：在固定/停止液并轻摇3-5分钟；冲洗：用重蒸水冲洗2次，每次2分钟；干胶：室温下自然干燥过夜。AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism)n原理：n基于RFLP技术和PCR技术的结 合 DNAMseI -MseI MseI -EcoRI EcoRI -EcoRIlMseI -MseI片段环化，不利小片段扩增；lEcoRI -EcoRI 引物的退火温度高；lMseI -EcoRI 片段优先扩增酶切连接接头序列nMse 接头、Pst 分别为：nMse： n 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
