基因诊断(2010级研究生)

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1、基因诊断gene diagnosis心血管病研究所、生命科学研究中心唐朝克 博士、教授、博导1 1n自1976年采用分子杂杂交技术术首次完成了对对地中海贫贫血的基因诊诊断以来，基因诊诊断的方法学研究取得了很大进进展，先后建立了限制性内切酶酶譜分析、核酸分子杂杂交、限制性片段长长度多态态性连锁连锁 分析、聚合酶链链反应应（PCR），以及近年发发展起来的DNA芯片等方法。2 2主要内容1 基因诊诊断的原理和主要技术术2 基因诊诊断在遗传遗传 病诊诊断中的应应用 3 基因诊断在法医学中的应用 4 基因诊断在感染性疾病中的应用 5 基因诊断在肿瘤学中的应用 3 3第一节节 基因诊诊断的原理和主要技术术

2、 一、基因诊诊断的定义义 二、基因诊诊断的优优点三、基因诊诊断的主要技术术4 4一、基因诊诊断的定义义 基因诊诊断是通过过直接探查查基因的存在状态态或缺陷对对疾病作出诊诊断的方法。基因诊诊断的探测测目的物是DNA或RNA。前者反映基因的存在状态态，而后者反映了基因的表达状态态。探查查的基因又分为为内源基因（即机体自身的基因）和外源基因（如病毒、细细菌等）两种。前者用于诊诊断基因有无病变变，而后者用于诊诊断有无病原体感染。5 5二、基因诊诊断的优优点 n传统传统 的诊诊断方法是先发现发现 疾病的表型，再把基因产产物即蛋白质质或其抗体氨基酸序列弄清楚，运用分子生物学技术术分离到该该基因，并通过过測

3、序确定突变变部位。6 6n基因诊诊断又称逆向遗传遗传 学，先找出基因变变异，再分析基因产产物，最终终探明生理作用的临临床机制。因此基因诊诊断往往在疾病出现现之前就可以完成，在诊诊断时间时间 上存在显显著的优优越性，有利于及时时治疗疗。 7 7n基因诊诊断检查检查 的是基因DNA，人体所有细细胞的基因变变化是一致的。因此，只要抽血检测检测 血细细胞，或检测检测 羊水中的脱落细细胞，就可以进进行基因诊诊断。而不需要对对某一特定的组织组织 或器官进进行检测检测 。因此，亦不受空间间限制，使用十分方便。 8 8基因诊断特点1 高特异性: 碱基配对原则.2 高灵敏性: 高灵敏标记的探针及PCR扩增3 应

4、用广泛性: 遗传遗传 病和产产前诊诊断;法医学; 感染性疾病;肿瘤.9 9二、基因诊诊断的主要技术术 n核酸分子杂杂交(nucleic acid hybridization)n聚合酶链反应(PCR)n单链单链 构象多态态性检测检测 (SSCP)n限制性片段长度多态性(RFLP)分析法nDNA序列测定nDNA芯片技术术。1010(一）单链单链 构象多态态性检测检测 n单链单链 构象多态态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)检测检测 是一种基于单单链链DNA构象差别别来检测检测 点突变变的方法。DNA经变经变 性形成单链单链 后，在中性条件

5、下单链单链DNA会因其分子内碱基之间间的相互作用，形成一定的立体构象。1111n相同长长度的单单链链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样这样 就形成了单链单链 构象多态态性。长长度相同而构象不同的单链单链 DNA在非变变性聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳中表现现出不同的迁移率。SSCP常与PCR联联合应应用，称为为PCR-SSCP技术术。121213131414珠蛋白1515(二)限制性片段长度多态性(RFLP)分析法n在人群中, 个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性, 称为DNA的多态性。n突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA序列发生改变。其中有些可能造成限制酶酶切位点的增加、

6、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶酶切位点数目、位置发生改变。1616n用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，这就是限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)。能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点。1717n限制酶酶切图谱分析法 基因突变变可能导导致基因上某一限制酶识别识别 位点的丢丢失或其相对对位置发发生改变变，以此酶消化待测测DNA和野生型DNA，通过过比较较二者的酶切片段的长长度、数量上的差异就可判断待测测DNA的突变变情况。1818Restriction endonu

7、clease enzymes recognize specific palandromic sequences of deoxyribonucleotide bases and split each DNA strand at a specific site within that sequence. This one, called Eco R1, recognizes the base sequence “G-A-A T-T-C“ and cuts each strand between the “G“ and the “A“ as shown by the red arrow.19192

8、0202121第二节节、基因诊诊断在遗传遗传 病诊诊断中的应应用 n基因诊诊断是在分子遗传遗传 学的基础础上发发展起来的，最早用于遗传遗传 病的诊诊断，而且现现在已经经知道许许多遗传遗传 病的致病基因及其突变类变类 型。因此基因诊诊断在遗传遗传 病中所取得的成绩绩最为为突出。现以地中海贫血发生的分子缺陷为例, 作一简单介绍. 2222n1) 基因缺失： 由于珠蛋白基因缺失所致的地贫贫迄今已发现发现 20多种，由于缺乏的基因及其部位的不同，导导致不同珠蛋白链链合成的异常和不同类类型的地中海贫贫血。n2) 终终止密码码突变变：n由于终终止密码码突变变生成肽链肽链 延长长的异常血红红蛋白。 2323

9、n3) 单单个碱基替代：珠蛋白基因中某些碱基发发生替代可能会影响珠蛋白链链的合成速率，导导致地中海贫贫血。大致区分为为两类类： 生成极不稳稳定的异常血红红蛋白：结结果异常链链迅速降解，珠蛋白链链的净净合成实际实际 上等于0，如 112胱氨酸（UGU）-精氨酸（CGU）； 125亮氨酸（CTG）-脯氨酸（CCG）。2424n 珠蛋白mRNA前体加工缺陷：在靠近内含子的编码编码 区若发发生碱基替代，往往改变变了mRNA前体分子被剪接酶识别识别 的部位，导导致mRNA前体加工为为mRNA的过过程迟缓迟缓 ，甚至加工无效，产产生地中海贫贫血,如 26谷氨酸（GAG）-赖赖氨酸（AAG）。2525n4)

10、 移码突变(frame shift mutation)：n由于碱基的插入或缺失，造成编码区阅读框的 移位，形成不成熟的终止密码子。n5) 无义突变(nonsense mutation)：n指正常的密码子变为终止密码子，肽链合成提 前终止。n6) 错义突变(missense mutation): n指基因编码序列中碱基的置换导致了某一密码 子的改变,从而使其编码另一种胺基酸。262627272828292930303131n导导致地贫贫的分子基础础主要为为珠蛋白基因缺失，而地中海贫贫血则则主要由珠蛋白基因的点突变变所致。迄今，世界上已发现发现 了120种不同的地中海贫贫血类类型，而导导致中国人地

11、中海贫贫血的突变变有15种。n大多数地中海贫贫血是由于珠蛋白基因缺失所致，而最终终都导导致珠蛋白mRNA含量的减少。因此，对对地中海贫贫血的基因诊诊断有两类类： 3232n一类类是检测其DNA:n方法:1 放射性核素标记标记 珠蛋白DNA探针针,n2 从羊水细细胞提取的DNA进进行液体分子杂杂交，n3 DNA限制性内切酶酶谱谱分析法，n4 PCR 法检测检测 珠蛋白基因有无缺失；n另一类则类则 是检测检测 其mRNA含量: 方法: 用RT-PCR 法3333第三节 基因诊断在法医学中的应用 n一、DNA指纹在法医学中的应用n(一)原理n法庭科学中DNA的检测目的有两个，即个人识别和亲子鉴定。在

12、法庭科学中应用DNA分析技术最早的报道是在1985年。3434n英国遗传学家Jeffreys发现同一个体不同来源组织的DNA,在Southern印迹图上的DNA谱带完全一致。 Sir Alec Jeffreys, inventor of DNA fingerprinting3535n除同卵双生外,不同个体之间谱带都不相同，就象人的指纹具有高度个体特异性一样，制备出具有个体特异性的限制性片段长度多态性图谱，称为DNA指纹，并成功地运用于个人识别和亲子鉴定。36363737酶 切 图 谱3838(二)DNA指纹个体特异性的分子基础 n人类染色体上小卫星DNA的高可变区（hypervariable

13、region,HVR）是由头尾相连的串联重复序列（tandem repeat,TR）组成，TR的核心序列同源性很高，等位HVR的长度由于TR的重复次数不同而有很大的差别。n它是由不等交换和脱落引起，这样的重复序列被命名为VNTR（varial number tandem repeats）,在Southern印迹杂交图上表现为丰富的RFLP，这就是DNA指纹个体特异性的基础。393940404141(三)DNA指纹分析所采用的方法 n目前普遍采用Southern印迹杂交法进行DNA指纹分析，称为RFLP法。采用PCR方法扩增VNTR区域，称为AMP-FLP或PCR-FLP。 Southern印迹

14、杂交法是进行DNA指纹分析的主要手段，其操作与一般的RFLP分析基本相同。42424343（四）DNA指纹技术在法医科学中的应用nDNA指纹个体识别率很高，凡是需要进行组织个体来源判别的分析都可应用DNA指纹分析。最先也是应用最多的领域是法医学鉴定，其它如双生子鉴定、骨髓移植后移植物存活检测、肿瘤DNA重排筛查的动物个体识别等。 4444nDNA指纹技术发展很快，但随之而来问题的是犯罪物证的量有时很少，不足以用来进行DNA指纹分析，应用多位点探针进行RFLP分析时高分子量DNA的量大于0.5g时才有可能得出可靠的结论，而用单位点探针时高分子量DNA也应大于0.1g,但实际工作中往往不能获得大量

15、DNA。 4545nPCR技术的应用，有效地解决了这些问题，对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根头发，一滴血，少量精液甚至单个精子都可能用于分析。PCR技术用于生物物证的分析与RFLP技术相比，操作简单，省时，成本低廉，还可以避免同位素所带来的一系列问题，如放射性污染，操作时的人身防护，以及来源困难等。 4646第四节 基因诊断在感染性疾病中的应用 n由于基因诊断具有高度敏感性和特异性，操作简便、迅速。因此，广泛应用于病毒、细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体以及寄生虫感染的诊断。 4747一、病 毒 n（一）人乳头瘤病毒（HPV） n迄今HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测，只能

16、采用分子生物学技术来诊断，主要方法有核酸杂交，PCR或两者结合。 4848（二）肝炎病毒的检测 n乙型肝炎病毒（HBV）感染的诊断，主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBc及抗-Hbe的存在，免疫测定法简单易行，重复性好，具有重要的临床价值。但是在某些特定的情况下，基因诊断显示其独特的优越性。 4949n1、当病毒基因组发生变异时，免疫测定可为阴性而PCR仍可检出；n2、应用PCR可对患者血中的HBV浓度进行粗略定量而对临床治疗及预后判断具有重要意义；n3、适用于病毒滴度很低的临床标本检测；n4、用于考核抗病毒治疗效果；n5、明确HBV复制状态及传染性；n6、在HBV与原发性肝癌关系的研究中发挥重要作用。 5050（三）HIV n艾滋病是严重威胁人类生命的疾病之一。目前用于HIV的检测方法很多，包括病毒体外培养法、逆转录酶法、外周血中抗原直接测定等。这些方法费时、费力、稳定性较差。 5151n原位杂交可直接检测有逆转录活性的细胞内病毒核酸；Southern印迹法可同时