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1、酸水解大豆异黄酮的研究报告人：蒋磊目 录研究的目的和意义国内外研究动态和趋势实验方法结果与讨论结论一. 研究的目的和意义大豆是我国最重要的农作物之一，种 植几乎遍布全国，随着对大豆功能性成分 的研究不断深入，大豆的综合利用越来越 受到世界各国的关注。因此，我国在 80 年 代以后，逐渐重视起大豆深加工。大豆深 加工高新技术的应用，是我国大豆行业发 展的必由之路。目前，对高低温豆粕连续提取大豆蛋白、大豆核酸、大豆低聚糖、大豆皂甙和大豆 异黄酮等大豆深加工项目已成为众多企业看 好的高新科技项目，倍受企业青睐。其中， 大豆异黄酮是大豆中一类重要的非营养成分 ，是目前大豆中最引人注目的一种功能成分 。
2、它不但附加值高，且不影响其它功能物质 的提取，有很高的经济价值。大豆异黄酮是大豆等豆科植物生长过 程中形成的一类次生代谢产物,在自然界中 分布有限,是九十年代中后期逐渐受到人们 关注的一类生物类黄酮,具有极大的开发潜 力。大豆异黄酮主要是指以3 苯并吡喃酮为母核的化合物。迄今已从大豆中分离 出9种异黄酮糖苷和3种相应的糖苷配基(即 游离异黄酮,也称苷元) 1。葡萄糖苷配基以游离的形式存在于大豆 中, 主要有染料木素、大豆苷元和大豆黄素, 这三种异黄酮在大豆籽粒中含量甚少, 约占 异黄酮含量的 2 % 3 %。大豆籽粒中有97 %98 %的异黄酮是以葡萄糖苷和结合型糖苷的形式存在。葡萄糖苷型包括
3、染料木苷、 大豆苷、黄豆苷；结合型糖苷包括乙酰型和 丙二酰型葡萄糖苷共6 种 2。大豆异黄酮在美国市场上被称为“大豆奇 迹”。当前美国的药学、医学、食品、营养学 等方面的专家已认可这样一个事实:即每天服 用3060mg大豆异黄酮,能明显降低血液中 胆固醇的含量,能有效地消除妇女更年期的不 适症,并能减少某些癌症的发生机会4。越来 越多的研究表明5-8:大豆异黄酮具有预防癌症 、心血管疾病、骨质疏松症和降低妇女更年 期综合症等生理功能。大豆及大豆食品中的大豆异黄酮主要以 糖苷形式存在,人体一般不能直接吸收糖苷 形式的异黄酮，须在人体小肠内通过葡萄 糖苷酶水解后才能吸收。据研究表明：人 体对异黄酮
4、苷元有更高的吸收率，在血浆 中异黄酮苷元可以较长时间保持稳定的浓 度，并且大豆异黄酮苷元表现出更强的抗 氧化性，以上表明异黄酮苷元比其糖苷形 式有更高的生物利用率9-10。所以通过水解 的方法获得富含异黄酮苷元的异黄酮保健 品具有重要意义。目前水解大豆异黄酮主要有酸水解，酶 水解，微生物水解等方法。由于酶水解成 本比较高，微生物水解难以进行控制而且 周期较长，而酸水解不仅工艺简单，操作 步骤少，利于控制，并且水解与前几种方 法相比水解率较高，故选用此方法进行研 究。二.国内外研究动态和趋势2.1 大豆异黄酮的研究至今分为四个阶段：第一阶段：对大豆异黄酮的报道起始于1931年， Walz用甲醇从
5、豆奶中首先提取出5，7，4 三羟基异黄酮7葡萄糖苷，并发现它能被酸水解成一分子的染料木黄酮和一分子 葡萄糖。第二阶段：随着大豆异黄酮的生理功能研究的逐步深入 ，人们对它的看法大大改变，因此使大豆异黄酮 的分离鉴定成为新一轮的热点。第三阶段：1995年以后，研究者的目光更多的转向了大 豆异黄酮提取纯化及其糖苷的水解。第四阶段：随着生物技术的发展，大豆异黄酮的研究也 进入了新时期。通过生物工程方法，鉴定了在大 豆子株生长过程中合成异黄酮的主要酶，并对其 进行了分离。2.2 药理学及药效学研究概况据流行病学、免疫学、动物体内外试验 证明，大豆异黄酮具有抗癌、防骨质疏松、 改善妇女更年期症状、防治心血
6、管疾病、防 止脂质过氧化、预防糖尿病等多方面的生理 功能。毒理学试验证明大豆异黄酮无毒副作 用，1999年10月美国食品和药品管理局将大 豆列为能够真正降低患心脏病危险的少数食 品之一。因此，富含异黄酮的功能食品，这 对改善人民健康水平具有重要意义。三. 试验方法准确称取0.100g大豆异黄酮粗提物样品 ，用5mL乙醇（95%）溶解，然后用盐酸 溶液定容到10mL于一定温度的水浴中密闭 震荡，摇匀，冷却至室温后离心，取上清 液经0.45m微孔滤膜过滤，稀释到一定倍 数后上高效液相色谱测量。3.1 高效液相色谱( HPLC ) 检测大豆苷元和染料木素溶解后的大豆异黄酮样品注入反相化学 键合体系,
7、按成分化学性质的不同,从柱中先 后流出,经紫外检测器检测,通过与标准品对照进行定量、定性。高效液相色谱条件如下：Hypersil ODS2（C18）200mm4.6mm，5m；流动相：甲醇：乙腈：0.1%磷酸（30：8：62）检测波长：254nm； 流速：1.2mL/min；进样量：5L； 柱温为室温；大豆苷元和染料木素在此液谱条件下，分离效 果良好。在大豆苷元浓度为0.01-0.1mg/mL范围取5个浓度进行 高效液相色谱测量；标准曲线为y=149.62x-0.6547；R2=0.9998,平均回收率95.78%；确定大豆苷元在此浓度范围内有线形关系； 在染料木素浓度为0.005-0.06m
8、g/mL范围取5个浓度值 进行高效液相色谱测量；标准曲线为y=20.622x-0.0716；R2=0.9993,平均回收率98.15%；确定染料木素在此浓度范围内有线形关系。四. 结果与讨论通过对水解时间，水解温度和盐酸浓度 三个因素进行回归旋转设计，如表 1 。采 用SAS软件进行数据统计分析，探寻三个因素与水解后大豆苷元和染料木黄酮总含量 的关系，以大豆苷元和染料木素总含量为 指标，得出大豆异黄酮的最佳水解条件。表 1 因素水平编码表编码值编码值水解时间时间 (min)水解温度 ()盐盐酸浓浓度(M)r=1.683609561295854.780200703-1105551.22-r=-1
9、.6840450通过SAS软件分析得出大豆异黄酮酸水解参数方程：Y= 3.52490.7058X10.1131X2 0.0105X1X20.0005X1X30.0009X220.032X12下面三个曲面图为一个因素取定值（中间值），其他两个因素对水解后大豆苷元和染料木素总浓 度的影响。图 1 盐酸浓度和水解温度对大豆苷元和染料木素总浓度的影响图 1 为水解时间为200min条件下盐酸浓度和 水解温度对水解后大豆苷元和染料木素总浓度的 影响，从上图我们可以看出，随着温度和盐酸浓 度的升高，大豆苷元和染料木素的浓度逐渐升高 ，而且在较高的温度和盐酸浓度下增加较为明显 ，这与大豆异黄酮在高温作用下会
10、水解为苷元形 式的性质相符合。由于实际生产中过高的盐酸浓 度对生产有很大影响，所以提高水解温度对提高 大豆异黄酮的水解效率是一个适合的方法。图 2 水解时间和水解温度对大豆苷元和染料木素浓度的影响图 2 为盐酸浓度为3M条件下水解温度 和水解时间对大豆苷元和染料木素浓度的 影响，从图中我们可以看出，温度对大豆 异黄酮水解的影响要远大于水解时间，而 且在高温条件下过长的时间会导致大豆苷 元和染料木素的浓度降低，所以，我们可 以通过提高温度来加快水解的速度，并提 高产量。图 3 盐酸浓度和水解时间对大豆苷元和染料木素浓度的影响图 3 为在水解温度为70条件下，盐酸浓 度和水解时间对大豆苷元和染料木
11、素浓度的 影响，我们可以看出，盐酸浓度对大豆异黄 酮的影响要大于水解时间的影响，而且水解 过长时间仍然可以导致大豆苷元和染料木素 总含量的降低，我们可以通过提高盐酸浓度 加快大豆异黄酮的水解速度并提高产量。我们通过对数据进行分析得出最优的水解 条件：水解时间200min、水解温度95、盐 酸浓度6M。下面两幅图为在最优条件（6M、95 、200min）下大豆异黄酮水解前后的 HPLC谱图：l 图4 水解前的大豆异黄酮色谱图l 图5 水解后的大豆异黄酮色谱图从上图可以看出，水解前大豆苷（6号峰 ）和染料木苷（8号峰）浓度非常高，大豆苷 元（10号峰）和染料木素（未检出）含量非 常低，而水解后的大
12、豆苷元（7号峰）和染料 木素（9号峰）浓度大幅度增加，大豆苷和染 料木苷及其它异构体浓度则非常低，说明水 解已经很充分。五. 结论通过高效液相色谱对大豆异黄酮水解前 后进行跟踪监测，用SAS软件对所得数据 进行统计分析，得出结论：大豆异黄酮在 高温高酸性溶液中水解比较充分；温度是 对大豆异黄酮水解影响的最主要因素；其 次为盐酸浓度；水解时间在200min左右较 为合适，如果水解时间过长，苷元浓度反 而降低，可能由于苷元降解所致。最后通过数据分析得出最优的大豆异黄 酮的水解条件：水解时间200min、水解温 度95、盐酸浓度6M。在此条件下，大豆 异黄酮可以得到充分的水解，大豆苷和染 料木苷及其
13、丙二酰，乙二酰异构体已经几 乎全部转化为大豆苷元和染料木素。本试 验希望能为工业化生产高生物活性的大豆 异黄酮健康食品提供理论参数。 参 考 文 献 1 张炳文，郝征红等. 糖苷型大豆异黄酮酸水解工艺的研究J. 食品科学. 2002，23（6）：75-78.2 史宣明，岳琳等. 大豆异黄酮的提取及精制J.中国油脂. 2001，26（2 ）：3-5.3 顾洵，石煌. 美国政府向民众推荐吃黄豆J.食品与发酵工业. 2000，26 （4）：95-97.4 Naim, M. ,Gestetner, et al. Antioxidative and antihemolytic activities of
14、 soybean isoflavonesJ. J.Agri. Food Chem. 1976,24: 1174-1177.5 Coward, L., Barnes, et al. genistein, dadzein and their - glucosidase conjugates: antitumor isoflavones in soybean foods from American and Asian dietsJ. J.Agric.Food Chem. 1993, 41: 1961-1967.6 史林娜，苏宜香. 大豆异黄酮类对去卵巢大鼠骨丢失的影响 J. 营养学报. 2000，2
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