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1、药品微生物检验特点药品微生物检验特点 及过程控制及过程控制中国药品生物制品检定所web site: e-mail: tel:010-67095509 地址：北京市天坛西里2号 邮编：100050 1药品微生物检验特点及过程控制药品微生物检验特点及过程控制l药品因 素l环境影 响l培养观 察l抽样检 查l破坏试 验方法验证过程控制2中国药品生物制品检定所无菌/微生物限度检查理念环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断3中国药品生物制品检定所微生物检查的过程控制l一、实验设施（硬件物质保障）l二、检验程序（软件有效的结果）l三、结果判断（调查可
2、靠的结论）4中国药品生物制品检定所一、实验设施l实验室系统l操作环境l关键设备l对照培养基物 质 保 障5中国药品生物制品检定所（一）、实验室系统洁净实验条件l有效性：整体10000级、局部100级。l安全性：保护样品、人员和环境。l可操作性：方便、快捷、顺畅。洁净实验条件的维护、验证阳性菌实验室达到P2生物安全标准6中国药品生物制品检定所实验室改造示例：原布局图拟定布局图 建议布局图1建议布局图2 实验室系统中检所微生物实验室7中国药品生物制品检定所（一）、实验室系统实验室系统的管理与维护： 1、屏障系统的有效性压差、风速、微粒、照度（外包服务合同） 2、清洁、静态与动态监控、熏蒸 3、环境
3、菌库酒精棉球分离微生物新洁尔灭分离微生物8中国药品生物制品检定所环境菌库洁净环境常见菌（浮游菌）：l头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis）l溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）l缓症链球菌（Streptococcus mitis）l科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）l藤黄微球菌（Micrococcus luteus）9中国药品生物制品检定所（二）、操作环境l1、隔离器l2、生物安全柜l3、超净工作台10中国药品生物制品检定所（二）、操作环境分类样品安全人员安全环境要求点评隔离器？验证困难，灭菌不彻底：假阳性灭菌剂残
4、留：假阴性生物安全柜？动态验证困难，不适合多任务的 检验活动超净工作台经典、廉价、适合多任务的检验 活动。提高实验室新风供给、加 强实验室监控可以扬长避短11中国药品生物制品检定所搽拭实验菌株菌液计数回收计数回收率大肠埃希菌191894.7%金黄色葡萄球菌646093.8%菌液稀释、分液的误差为：5.5% 表面搽拭操作的回收率大于 99%12中国药品生物制品检定所（三）、关键设备 微生物检查薄膜过滤仪 一次性薄膜过滤培养器应急检验用一次性薄膜过滤培养器13中国药品生物制品检定所（四）、对照培养基 培养基适用性（灵敏度）； 培养基性能稳定性（标准化）。对照培养基理化评价（可控性）生物学评价（有效
5、性）回收率比较MPN比较生长曲线比较生态评价某些CRS原则固态培养基液态培养基琼脂加减法14中国药品生物制品检定所二、检验程序环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断15中国药品生物制品检定所二、检验程序l接受任务l实验方案l实验准备l样品核对l实验操作l过程监控l培养观察有效的结果物 质 保 障16中国药品生物制品检定所实验室管理规范（软件）中检所抗生素室微生物实验室质量管理体系l编写说明及批准页 l1 实验室概况l1.1 实验室简介 l1.2 实验室通讯资料 l1.3 实验室认可项目/参数表l1.4 实验室平面图及功能区域 l1.5 仪
6、器设备总览l1.6 常备试剂耗材一览表l1.7 实验室发展目标l2 管理规范l2.1 安全管理l2.2 业务流程l2.3 人员管理（6个SOP）l2.4 样品管理（3个SOP）l3 标准操作规程l3.1 检验工作SOP（13个）l3.2 仪器操作SOP（30个）l3.3 实验记录SOP（9个）l4 实验室保障l4.1 实验室设施、设备及消耗品供应商确定原则l4.2 实验室设施服务商l4.3 实验设备供应商l4.4 实验室消耗品供应商17中国药品生物制品检定所（一）、实验准备l实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无 患，应随时保证“来之能战” 。l尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、 冲洗
7、液、滤器、小型实验器材等。18中国药品生物制品检定所实验准备无菌室专用酒精棉球制备 实验准备场地清洁 实验准备台面清洁19中国药品生物制品检定所（二）、样品核对l尽快取得样品，确保样品传递过程中的 完整性、安全性、有效性；l仔细核对样品及样品资料，高度关注媒 体公布样品（问题样品），同时尽量获 取非问题样品及同类样品，进行比较实 验、比较分析；l样品外观检查、完整性检查。20中国药品生物制品检定所样品外观检查欣弗 样品外观检查刺五加 样品外观检查双黄连样品完整性真空检漏21中国药品生物制品检定所（三）、实验操作l不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免 实验室污染。实验人员 培养基实验器材实
8、验环境检验结果待检样品原料 辅料 设备环境药品（食品）人员 药品食品生产过 程中可能污染微 生物的主要环节药品食品微生物检 查过程中可能污染 微生物的主要环节22中国药品生物制品检定所实验操作物料进场消毒液搽拭 物品外表面洁净传递（风 淋、紫外照射 ）双层无菌包装核心区外围实验操作人员进场一更二更核心操作区实验操作无菌操作技术23中国药品生物制品检定所（四）、实验过程监控样品监控手指监控沉降菌监控无菌检验框架示意图24中国药品生物制品检定所三、结果判断l长菌与否l分离鉴定l溯源调查l结果报告可靠的结论有效的结果物 质 保 障25中国药品生物制品检定所三、结果判断是不是微生物？是什么微生物？微生
9、物来自哪里？几点思考参见：FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的相似性 考 察药学学报，2007，42（11）：11891194 判断无菌检查阳性结果有效性的实验探讨药物分析杂志，2008， 28（05）：6671 26中国药品生物制品检定所1、长菌与否？l浑不浑浊?l物理变化、化学变 化还是生物变化？一靠经验 二靠实验 三靠严格程序控制避免干扰27中国药品生物制品检定所是不是微生物？（1）、液体培养基浑浊物理变化？化学变化？生物学变化？ （2）、平板上的菌落琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层菌落or药渣？28中国药品生物制品检定所菌落or药渣？l经60Co射线大剂量照射再检验l
10、延长培养时间到7天l重新划线培养l镜检29中国药品生物制品检定所2、分离鉴定l（1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中 继续培养；l（2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物 ，-80保存；l（3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线 ，分离污染微生物；l（4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊 ，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养 分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴 定，并逐一保藏。30中国药品生物制品检定所是什么微生物？宏观：生长形态 微观：镜检 鉴定：生化鉴定（API、BD）核酸鉴定（16sRNA、DNA）31中国药品生物制品检定所3、溯源调查l样品阳性培养物分离菌株l
11、检验过程监控菌株l环境菌（近期、远期）l现场调查收集菌株鉴定与相似性分析相结合传统方法与新技术相结合不同方法的交叉验证32中国药品生物制品检定所微生物来自哪里？相似性分析同源性分析脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR ）33中国药品生物制品检定所Sample Preparation Automated measurement after drying of the samples!2. Suspending1. Harvesting3. LoadingFT-IR Spektrum of microorganisms图 不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系34中国药品生物制品检定所The
12、 Infrared Spectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercell wall capsules DNA, RNA flagellates, pili ribosome vacuoles .FT-IR spectrum is a fingerprint of the cellsBiochemical Structure of Cells35中国药品生物制品检定所36中国药品生物制品检定所溯源性分析例1欣弗事件 图29 欣弗培养物图30 欣弗培养物分离菌株镜检37中国药品生物制品检定所编号滤筒中形态革兰染色BD鉴定0206L浑浊，产气1、G-球杆
13、菌 2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）； 2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens） 0206G浑浊，剧烈产气1、G-球杆菌 2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）； 2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens） 0112G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片） 0104L颗粒状悬浮物，振摇能散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）298L； 298G浑浊，产气1、G-球杆菌 2、G-短杆菌1、肺炎克
14、雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）； 2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens） 303L； 303G浑浊，产气1、G-球杆菌 2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）； 2、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae） 305L； 305G浑浊，产气1、G-球杆菌 2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）； 2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens） 306L
15、； 306G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）307G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae） 308L浑浊（Alcaligenes faecalis） 308G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）309L浑浊（Alcaligenes faecalis） 309G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）304G浑浊G-杆菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）3
16、8中国药品生物制品检定所溯源性分析例1欣弗事件 头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcus capitis ssp capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcus cohnii ssp cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。监测到的环境菌株39中国药品生物制品检定所溯源性分析例2编号BD鉴鉴定走廊1B.pumilus 走廊2M.luteus 走廊3/无菌室4C.urealyticum 无菌室5K.kris
