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1、用于出血和血栓性疾病 治疗的血液制品中国医学科学院输血研究所 王憬惺 用于出血或血栓性 疾病治疗的血液制品及其临床适应症 血源性血液制品冷沉淀制品、凝血因子VIII浓缩制品、 凝血酶原复合物制品、凝血因子IX浓缩 制品 纤维蛋白原制品、纤维蛋白粘合剂 抗凝血酶 III、蛋白C制品临床使用安全性的现状基因重组的血液制品重组人凝血因子VIII 重组人凝血因子VIIa 重组人凝血因子IX重组人激活的蛋白C（Activated protein C） 制造及临床使用的概况 一、血源性血液制品临床使用安全性的现状通过血源性血液制品传播的主要病毒 病毒 经血细胞传播 经血浆和血液制品传播 HAV 十 十 H
2、BV 十 十 HCV 十 十 HIV- l 十 十 HIV- 2 十 十 B 19PV 十 十 WNV 十 十 SARS ？ ？ vCJD ?! ?! 1.血源性凝血因子VIII传播HIV的惨痛教训在HIV检测技术和血液制品病毒灭活技术 未被实际使用前，血友病患者面临很高的感 染艾滋病的危险:法国、德国和加拿大的状告政府案、美 国的状告拜耳公司案、日本的状告政府和绿 十字公司案我国 1985年就报道了在浙江省18例使用 过进口凝血因子VIII制剂的血友病患者中查 出例HIV抗体阳性者；至2003年11月30日，我国的血友病患者 中，已经有62人因使用国产未经病毒灭活处 理的凝血因子VIII制剂
3、感染了艾滋病病毒。2. 我国为保障血液制品临床使用 安全性已采取的措施血液安全是一项系统工程，为保 障血液制品临床使用的安全性，我国 采取了下列综合措施：（1）1984年9月17日 , 中国政府 发布了“关于限制进口血液制品防止 AIDS病传入我国的通知”; 同年，血液制品病毒灭活技术的 研究在中国医学科学院输血研究所启 动，1992年开始实际用于凝血因子 VIII浓缩制品和静脉注射免疫球蛋白 制品的生产。 （2） 中国从1993年开始将 HIV抗体检测和HCV抗体检 测同时列为献血者筛查的必 检项目；并根据我国HBV的人 群高携带率的特点，对于血 液制品原料血浆的供浆者， 供浆前需进行乙型肝
4、炎疫苗 的免疫接种。 （3）1995年7月20日,中国卫生部下发了 “关于禁 止生产和临床使用未经病毒 去除或灭活的凝血因子类血 液制品的通知” ，使我国 生产的血液制品的安全性得 到进一步提高。（4）1997年12月29日,“中华人民共和国献血法 ” 颁布，中国开始告别有 偿供血，进入无偿献血的新 阶段。也从血液来源的层面 ，进一步提高了输血和血液 制品的安全性。因此，我国目前生产和使用的血 液制品，在病毒安全性方面是历史上 最高的。和提供临床使用的全血和血 细胞成分相比，由于在血液制品的生 产过程中全部采用了病毒去除和/或灭 活处理的措施，有更高的安全性。但是，和提供临床使用的全血和 血细
5、胞成分一样，血液制品的临床使 用至今仍不是100安全的。和发达国家相比，在保障血液制 品临床使用安全性所采取的措施方面 ，也仍有一定的差距。3. 发达国家为保障血液制品临床使用安全性已采取的措施发达国家血液安全措施随技术进步而更新：（1）检测（2）血浆储存（3）新病原 体二、基因重组血液制品临床使用的概况由于血源性血液制品有传播病毒性疾病 的危险，而基因重组血液制品不仅纯度极高 ，又无传播病毒性疾病之虞，使基因重组技 术生产血液制品这一开发领域十分活跃。目 前，已形成商品供应临床使用的有凝血因子 VIII、凝血因子VIIa、凝血因子IX和激活的 蛋白C四种基因重组血液制品。基因重组凝血因子VI
6、II不仅已在临床使 用的份额上与血源性凝血因子VIII产品平分 秋色，更可望在5年内（至2010年）在临床 使用的份额上占主导地位；基因重组凝血因 子VIIa则已成为非常有特色的产品，在临床的使用日趋广泛。 （一）重组人凝血因子VIII（rhFVIII ）1. 凝血因子VIII的分子生物学凝血因子VIII ( FVIII ) 基因位于X染色体长臂 ( Xq28 ), 基因长度 为186kb, 有26个外显子和25个内显子 。其mRNA长度为9kb, 编码由2351个氨 基酸残基组成的FVIII前体多肽，切除 N末端由19个氨基酸残基组成的信号肽 后，成熟的FVIII分子由2332个氨基酸 残基
7、组成。在血浆中，FVIII是由一条从C端衍生来的分 子量为80kd的轻链 ( A3-C1-C2)和一条从N端衍生 来的分子量为90-200kd的重链 ( A1-A2, 或A1-A2-B )组成；轻、重链之间经Ca2+以非共价键相结合。 重链与FVIII促凝活性 ( FVIII:C )有关，轻链则对 FVIII和von Willebrand因子 ( vWF )的结合具有重 要性。2. 基因工程FVIII制品的生产和临床 应用(1) 基因工程FVIII制品的生产FVIII基因在基因工程改造后的哺乳 动物细胞内的表达：如美国 Baxter公司 选用中国仓鼠卵巢细胞 ( CHO )株，重组 基因可同时
8、表达重组FVIII ( r FVIII )和 重组vWF ( r vWF ) 蛋白；由于vWF是 rFVIII的稳定成分，是在细胞培养基中生 产rFVIII所必需的，因此生产细胞株本身 同时表达rvWF乃是一种既经济又易于控制的过程。 重组因子VIII ( Recombinate ) 的制备 过程A. 建立适用于生产的细胞库体系，包括：主 细胞库( MCB )、工作细胞库 ( WCB )、延伸细 胞库 ( ECB )和中间细胞库 ( ICB )。B. 对WCB的细胞进行一系列鉴定，以确保每 一批都符合预定的标准：a. 致肿瘤性; b. 鉴别试 验; c. 生产性能标准; d. 工作细胞库的稳定
9、性。C. 重组细胞的扩增培养, 收获细胞悬液, 经分 离、免疫亲和层析、以及两种离子交换层析的 纯化过程，就可获得rFVIII制品。 rFVIII制品的质量保证FVIII制品的生产过程严格按GMP规定 的要求执行，质量保证体系包括：生产过程有效性验证，生产过程的监控 和取样检测，以及产品交付临床使用前的检 测。成品的检测除常规的理化和生物学检测 外，还包括rF特性的确定，如用加和不加 凝血酶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳 ( SDS-PAGE ) 进行多肽分析，凝血酶 裂解前后的逆相高压液相层析，FVIII:C测 定等。安全方面的特定检测项目包括CHO蛋 白、纯化时使用的单克隆抗体蛋白
10、、DNA 及其他混杂物质的残存量测定，必需低于预 定的标准。(2)基因工程FVIII制品的临床应用美国两家公司 ( Baxter 和Miles ) 生产的基 因工程FVIII制品，自1988年开始临床试验， 1992 年末至1993年初被美国食品和药品管理署 ( FDA )正式批准上市，供临床治疗血友病A患 者出血使用。至2004，年销售额已达20亿美元，在临床 使用的份额（提供的量）上与血源性凝血因子 VIII产品大约各占50。其疗效与血源性的FVIII制品无异，至今未 见传播病毒性疾病的报导，但产生抑制剂的发 生率似比输注血源性FVIII制品者稍高。（二）重组人凝血因子VIIa（ rhFV
11、IIa）1. 凝血因子VIIa的分子生物学和生理学FVII是一种以单链前体形式存在的糖 基化的维生素依赖的丝氨酸蛋白酶，分 子量为50kD，由406个氨基酸残基组成。 而具活性的FVIIa则是FVII的152位Arg和 153位Ile肽键断裂后形成的双链分子，其 轻链为23kD，重链为28kD，二者以链间 二硫键相连。在凝血外源性途径中， FVII占有举足轻重的地位。当血管损伤后，人体内的 组织因子（Tissue Factor,TF） 与血液中的FVII接触并在Ca2+ 参与下结合形成FVII-TF复合 物，其中的FVII被激活成VIIa ，血液中FVIIa含量升高后， 即触发一系列凝血反应，
12、达到 止血效果。 血管壁损伤导致血液 和内皮细胞的接触在细胞表面，FXa和FVa 结合TF 和 FVIIa复合物激活 FIX和FX组织因子 (TF) 被暴露， 并和FVIIa 或 FVII 结 合，后者随后也被激活 为 FVIIa凝血外源性途径的启动FXa/FVa 复合物将少 量凝血酶原激活成凝 血酶所形成的少量凝血酶激活 FVIII、FV、FXI和局部 的血小板，FXIa进而将 FIX激活成FIXa 放大相激活的血小板结合FVa、 FVIIIa和FIXa在激活的血小板表面， FVIIIa/FIXa复合物 激活FX“凝血酶爆发”导致纤维 蛋白凝块的形成FXa和FVa结合，将大量 凝血酶原激活成
13、凝血酶， 即“凝血酶爆发”.止血凝块的形成2. 人重组凝血因子FVIIa制品 的开发和临床应用以往人们普遍认为，血浆FVII水 平升高，是除了纤维蛋白原浓度升高 之外容易导致心、脑血管血栓性疾病 的又一病危因素。但研究表明，FVII-TF复合物只 形成于损伤部位局部，这就可以避免 全身性血栓形成的可能性。 在应用FVIII、FIX及凝血酶原复合物（PCC ）制剂治疗血友病患者的出血性疾病时，经常遇 到的问题就是抑制剂的产生。临床治疗这类血友病人的方法包括：输注 大剂量FVIII或FIX，免疫耐受治疗，输注猪 FVIII制品，使用 PCC 的凝血因子 VIII 抑制剂 旁路活性（ Factor
14、Eight Inhibitor Bypass Activity，FEIBA）。通常认为, FVIIa在PCC的FEIBA治疗中起着 关键的作用，应可用FVIIa代替PCC的FEIBA治 疗。（1） rhFVIIa制品的开发生产Hagen于1986年获得FVII的cDNA克隆 丹麦Novo公司生产的rFVIIa， NovoSeven 由于rFVIIa为糖基化蛋白，且富含半胱氨酸Cys 残基，故生产选用的表达体系为幼年仓鼠肾细胞（ baby hamster kidney cells, BHK）。从细胞培养上清中提取到的是单链rFVII，活性 仅为rFVIIa的%。但在离子交换层析中，rFVII会 被自动激活成双链的rFVIIa，激活的程度在一定程 度上取决于层析介质单位体积所吸附的FVII量，而 激活的起始则源于那部分低活性的单链FVII。（2） r
