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1、流式细胞术免疫标记应用简介2009-12-03流式细胞术系列讲座之免疫标记上次流式细胞术讲座内容（概述）=流式细胞术的一般介绍=流式细胞术在临床检测和科研中的应用流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构=细胞大小=细胞颗粒性程度=细胞表面面积=核浆比例=DNA含量与细胞周期=RNA含量细胞功能=细胞表面蛋白抗原=细胞胞浆内蛋白性 抗原=细胞内细胞因子=细胞增殖=细胞内钙离子浓度免疫标记技术 n免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位 素、酶、发光剂或电子致密物质等作为 示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗 体反应。n流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光
2、 标记技术FACSCalibur流式细胞仪能够检测的荧光 （Fluorescence）信号nFL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素）nFL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白）nFL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等nPL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）双色直接染色流式细胞术免疫荧光标记的应用=检测细胞表面蛋白抗原=检测细胞胞浆内蛋白性抗原=检测细胞内细胞因子=优势：在同一细胞上同时检 测多种标志血液系统各型细胞免疫标志nCD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着 细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。nCD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一， 并随
3、一定的分化过程表达上调 n最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞 标志n结合多种分化抗原的表达可以作为造血细胞不同发育 阶段的标志。如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标 志；CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向 的祖细胞。造祖/干细胞T细胞及其亚群 nT祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、 CD7+n未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。n在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志 ，且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。n胸腺细胞要分化发
4、育为有功能的成熟T细胞，细胞 表面标志需经历一定的变化过程。T细胞标志进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR- （即CD4、CD8双阴性）CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+ （即CD4、CD8双阳性）CD7+、CD2+、 CD3+、CD4+、 CD8-、TCR+CD7+、CD2+、 CD3+、CD4-、 CD8+、TCR+nCD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti）， 占T细胞总数的60%70%；nCD3+、CD4-、CD8+：T抑
5、制/杀伤细胞（Ts/Tc） ， 20%30%；nCD3+ CD4+ CD8+ ： 1%3%；nCD3+ CD4- CD8-：1%10%。前三种表型细胞的TCR主要为TCR，而CD4- CD8 - T细胞主要表达TCR，他们都执行细胞免疫功 能。正常外周血中通常存在的T细胞亚群n CD2是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相 关抗原-2（LFA-2），表达于人95%T细胞 、50%70胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞 （LGLNK）的表面。nCD3是T细胞表面抗原，表达于成熟胸腺细 胞、静息和激活的的外周血T细胞，是鉴定 T细胞的重要标志，其胞浆和膜CD3是早期 和普通型T细胞白血病的主要分型标记。 n CD
6、5、CD7是T细胞白血病较特异的标记， 也是髓系白血病时最常见的伴随标记。 CD45则是白细胞的共同标记抗体nCD25和CD28主要分布于活化T淋巴细胞表 面，为活化T淋巴细胞标志。胸腺细胞、静 止T细胞、静止B细胞以及NK细胞表面无表 达。n末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和II类人类 白细胞抗原（HLA-DR）的阳性表达对早期 T细胞白血病的诊断有重要价值。n8090和95以上的NK细胞表达CD16 和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定义NK 细胞。 B细胞标记B细胞 B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细 胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细 胞6个阶段。（1）B祖细胞（
7、pro-B）：此期最早表达的B细胞 特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、 HLA-DR、CD40、CyCD22。（2）前B细胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出现 CyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74，c+ （胞浆IgM重链）。（3）未成熟（早期）B细胞（immature B cell ）：CD9、CD10消失，出现 SIgM、CD22。CD20、 CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表达增 加。其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相 继出现。 （4）成熟B细胞（mature B cell）：SIgM和
8、 IgD同时表达，并出现CR、FcR和丝裂原受体，上 述B细胞抗原继续存在。（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟 B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞 ，继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞 激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活 相关抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、 CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型 Ig逐渐增加。（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得PC -1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表达 增加，CD38抗原再出现。而SIg和
9、上述B抗原消 失。CD79仍可存在于胞质中。B细胞上的CD抗原分为： B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、 CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志 。 B细胞相关性抗原： CD5、CD9、CD10、CD23、 CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74 、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、 CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。nB细胞表面的受体SIg，是B细胞特异性识别抗原 的受体，也是B细胞重要的特征标志。nCD19、CD20、CD21、
10、CD22和CD24都是B 细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。n对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最 高的。nCD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞 表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即 表达，持续存在直至B细胞终末阶段n外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板 表面不表达CD19。髓系细胞标记n包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33 、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、 CD61、CD63和CD117等。n这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏 感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。3.髓系标记 从髓系祖细胞终末分化的成熟细 胞（粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞
11、）间 各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。 根据粒细胞和单核细胞上的髓系抗原表达试将其 大致分为七种类型 :（1）粒细胞和单核细胞上都有较强表达的抗原有：CD13 、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、 CD156、CD157、CD163。其中CD13在原粒细胞质中表达 比膜上早，在AML诊断上十分重要。 （2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有： CD15和CD65。CD65是特异性髓系抗原，强表达在成熟 粒细胞，弱表达在单核细胞上。（3）基本表达在粒细胞上的抗原有：CD16b和CD66。 （4）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗 原有：CD14和
12、CD33。CD14主要强表达在单核- 巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。CD33抗原分布 只限于造血系统内，表达在髓系祖细胞CFU- GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血 病细胞上。（5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16 、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是 目前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细 胞系统的特异标志。 （6）造血干、祖细胞抗原有：CD34和 CD90。CD34除表达在早期造血干、祖细 胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL 上（7）其他髓系相关抗原：这些抗原主要 存在于其他系细胞上，但在某些髓系细 胞上也有表达，
13、如：CD4、CD7、CD9、 CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、 CD38等。 巨核细胞系n在巨核细胞系发育过程中依次出现PPO、CD41a（ b/a）、CD41b（b）和CD61（a）、CD42（b ）。还可表达CD36（强）。n 正常情况下血小板处于静止状态。目前研制出的抗血 小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b 、CD42a、 CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。n当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放，整合 到活化的血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62 （P-选择素）、CD63及CD107a和CD107b。红细胞
14、系 血型糖蛋白A、H。 流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择n有特异性标志：选择一种即可，如CD3标记总 T细胞；n没有明显的特异性标志：可以采用不同抗体组 合，标记某种细胞。如Treg细胞公认的标志为 CD4+CD25+FoxP3+.n表面分子标记可以与胞内分子标记相结合；n免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合 ：如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。流式细胞术表面分子免疫标记操作举例淋巴细胞亚群检测操作程序 一、实验原理：人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞
15、 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。二、主要试剂： MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)， 其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 3、FACSLysing Solution 三、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： 标本
16、管编号A，取两只流式专用管A1、A2。 A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL； A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。 A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。 置室温，避光孵育15min。 加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 300g离心5min，弃上清液。 PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 1%多聚甲醛0.5mL。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。 流式细胞术胞内分子免疫标记操作流程流式细胞术胞内分子免疫标记操作举例B淋巴细胞胞内ZAP-70分子检测操作程序 主要试剂：【临床意义】
