基因工程第五章-载体

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1、Chapter five vectorsAgriculture university of Hebei Provincev 载体的概念：载体是基因工程中携带目的基因进入宿主细胞， 可自我或随同宿主DNA的复制而复制，及表达的工具。 v 载体的条件：含有复制子：这是一段具有特殊结构的DNA序列，载体有复 制起始位点，才能携带外源基因进入宿主后，进行复制，保证 子代细胞仍含有外源基因。有一个或多个利于检测的遗传表型，易于识别和筛选。如抗 药性、显色表型、营养缺陷型、荧光表型等.有一个或几个限制性酶切酶的单一识别位点，便于外源基因 的插入。适当的拷贝数。高拷贝数不仅利于载体的制备，也有利于克 隆基因

2、的剂量的增加。载体的分类：质粒载体可容纳15KB的外源片断噬菌体载体2545KB人工染色体45KB以上v质粒是一种可进行自我复制的并能独立传播的DNA 的一种存在形式，并且自然界中原核生物、真核生 物大部分都发现有质粒的存在，所以质粒现在是应 用最广的载体plasmidsSection one一、质粒的生物学特性：v质粒最初发现于细菌中，是染色体外能自主复制的 双链共价闭合的环状DNA分子，是能够进行独立复 制并保持遗传恒定的复制子，大小在1200KB。质粒常含有一些编码对细菌生存有利的基因，比如 说抗性基因，降解复杂有机物的酶、细菌素，并且 可赋予微生物特殊的外形鞭毛、菌毛、芽孢 等。 如:

3、大肠杆菌中的F质粒、R质粒、COL质粒。v F质粒：又叫性质粒，他的存在决定大肠杆菌的性别，含有F 因子的菌株有一个特殊的结构性菌毛。v R质粒：又叫抗性因子，他们含有一种或几种抗生素的抗性基 因，编码一些酶类，可对抗生素进行修饰和降解。这样一旦微 生物具有了抗性质粒，就出现对抗生素的抗性。19591960 年日本人发现了抗药性因子。另外除了抗药特点外，有的质粒 具有抗砷、汞、银等重金属的特性，有的抗紫外等射线。v COL质粒：1952年发现的大肠杆菌含有这一因子可编码一种 奇怪的蛋白质抗菌物质大肠菌素。如何识别微生物是不是含有质粒？ v首先要看微生物的形态（同种微生物形态不同，可 能含有），

4、其次要从细胞中提取质粒。如荧光假单 孢菌。具有质粒的均有分泌抗生素的特性。二、质粒的遗传学特 性：1. 质粒DNA闭合的环状分子：迄今发现的大部分质粒都是环状分子，也有线性的。质粒分子三种存在形式：（主要与复制有关）v 共价闭合超螺旋形式：（covalently closed circular，简写 cccDNA）v 开放环结构：一条保持着完整的环结构，另一条有一个或数个 切刻。v 线性结构：质粒在限制性酶作用下，双链断裂，形成线性，又 叫L型。克隆只有超螺旋可用。2. cccDNA分子分离特 性：v 由于cccDNA分子团压成一个紧密 的结构，当我们用EBr、丫啶橙染 料分子作用后，线性分子

5、染料插入 的分子个数多，cccDNA插入的分 子个数少，密度大，所以沉降系数 大，进行密度梯度离心时可将其分 开v cccDNA在较较高高的温度和PH值值条件下才会变变性，（较较 线线性和开放环结环结 构的DNA），如果变变性，由于团团在一起 ，条件恢复后，会很快复性，形成cccDNA，线线性和环环状 的变变性后，复性会形成杂杂乱的大分子团团状结结构，从而从 体系中沉淀下来。3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：按质粒的分子量大小，可分为量大类：37kb，拷贝数多；70150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我 传递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从 一个细胞转到另一个细胞），如

6、果一个细胞含有这种质 粒，他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝 数低。 拷贝数是受一个定位在叫cop基因编码的阻遏物的控制， 质粒个数增加，合成的阻遏物的浓度增加，从而阻止质粒 的进一步合成。不像病毒DNA进行无限制的合成，直到 细胞裂解。4. 质粒DNA的复制类型：根据质粒复制所受控制的方式和在寄主细胞所含质粒拷贝数的多 少：松弛型：质粒的复制可自由完成，自身可编码与复制有关的功 能蛋白，所以在细胞的生命周期中，可随时进行自我复制，所 以松弛型的拷贝数多，每个细胞中由10200个不等。严紧型：质粒的复制的启动，受寄主细胞的复制起始蛋白的 调控，复制起始蛋白是细胞在进行DNA复制时产生

7、的，所以 严紧型质粒的复制是宿主细胞进行染色体复制时才能进行复制 的质粒，依赖于宿主细胞，自身不能合成复制起始蛋白。他随 染色体可平均分配到子细胞中。拷贝数少12个。5. 质粒的提取与纯化 ： v原理：理想的状态是细胞裂解后，大部分DNA释放到裂解液中，根据共价闭合环状的质粒DNA在pH12-12.5时，线性DNA会完全变性，而共价闭合环状的DNA只是氢键断裂，酸中和后，共价闭合环状的DNA迅速准确地复性，而线性DNA聚合成网状结构，与变性的蛋白和RNA一道离心沉淀，上清液中的质粒DNA用乙醇沉淀出来。v第一步：（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接 种一单菌落，于37剧烈振荡培养过夜。（

8、2）将 1.5m1培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于 4以12000rpm离心30秒。 （3）吸去培养液，使细 菌沉淀尽可能干燥。（4）将细菌沉淀重悬于100l用 冰预冷的溶液I中（溶液：50mmolL 葡萄糖， 25mmolL TrisCI (pH 80)， 10mmolL EDTA(pH 80，溶菌酶45mg，酶作用环境由缓冲 液提供)。剧烈振荡。须使细菌沉淀在溶液中完全分 散，将两个微量离心管的管底部互相接触，室温静止5 30min，细胞壁降解。v 第二步：加200l新配制的溶液（现用现配）（0.2mol L NaOH ，1 SDS）盖紧管口，快速颠 倒离心管，以 混合内容

9、物冰浴5min。SDS破坏原生质体，然后DNA变性 。时间是关键：长了变性不可逆，短了DNA没有变性。此时的现象应为变得澄清，和鼻涕一样粘。v 第三步：加150l用冰预冷的溶液（5molL乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，pH为4.8）。盖紧管口，温和地振 荡10秒钟使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后 将管置于冰上35分钟。中和作用使DNA形成网状的聚合 物，高浓度的乙酸钾 会引起蛋白质SDS复合物变性和 大分子RNA共同沉淀。v最后：4 12000rpm离心10分钟，将上清转移到另 一离心管中，上清中是质粒DNA。 加等体积氯 仿，振荡混匀， 412000rpm离心10分种，将上

10、清 转移到另一离心管中。用2倍体积的无水乙醇沉淀双 链DNA。温和振荡混匀，于-18放置20分钟。用微 量离心机于4以12000rpm离心10分钟。弃上清， 加入70%冷乙醇洗沉淀1-2次真空干燥DNA沉淀后， 将其溶于TE溶液中。 6.影响质粒产量的因素 ：l 寄主自身的遗传背景： v质粒一般都保藏在质粒中，所以质粒的稳定性直接 与寄主的特性有关，我们在基因工程中采用的寄主 细胞都是经过人为改造过得微生物，如JM110， JM109、XL1-Blue等，这些菌株的end基因均发生 了突变，end基因负责编码核酸内切酶I，突变后， 菌株就失去了编码能力，从而保证了质粒在宿主细 胞中稳定存在。

11、v所以，我们要想获得大量的质粒DNA，最好不要选 择野生型菌株作为宿主细胞。l 质粒的拷贝数：分子的多与寡是决定产量的重要因素。pBR322 拷贝数大于25个 产量0.23ug/mlColE1 15个 0.11 ug/ml基因克隆尽量选择松弛型质粒，如果是严紧型要进行质 粒复制子改造。l 质粒的大小：通常质粒越大，拷贝数也越少，所以我们 在进行基因重组时，首先要选择分子量小的质粒，其次 质粒分子量大的要使外源基因的片断长度合适，不要过 大。三、质粒载体的 构建天然质粒存在着不同程度的局限性，不能直接 作为基因克隆的载体，必须进行改造。便于转化、 筛选。 质粒的构建有三个方面：1. 引入易于检测

12、的选择性标记，去掉质粒的非必需序 列： 最早使用的质粒载体只有一个选择性标记：抗性基因 （一个标记有局限性：无法知道外源基因是不是转化 进入宿主细胞，因为空载体也可使菌株产生抗性）。第一个经改造的认为较完善的质粒载体是 pBR313, 他是松弛型载体，引入了两个标 记基因-抗四环素 基因Tecr和抗青霉素 基因Ampr, 他的外源基因插入位点在两个 抗性基因中 l 质粒的序列含有必要区和非必要区。必要区指的是与质粒DNA复制有关的基因，他们对 质粒的存活、复制极为重要。非必要区里存在着影响细胞性状的基因，编码产生 特殊的物质，另外还有一部分质粒片断至今不知其 功能。必要和非必要区各自独立，所以

13、我们可以把非必要 区去除，只留下必要区。 2. 调整质粒载体的结构，引入多克隆位点：新型载体都引入了一个人工合成的由多种常用限制 性内切酶单一识别位点组成的序列，叫多克隆位点 （multiple cloning site, MCS ）。 3. 引入多种用途的辅助序列，构建具有特化功能的载 体： l 构建质粒可用于组织化学方法的鉴定：pUC18载体带有 一个Lac操纵子的DNA区段，宿主细胞具有与之互补的 基因，当质粒进入宿主后，由于互补作用，而实现半 乳糖苷酶的表达（诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与 操作子脱离）。外源基因的插入会导致基因失活而检查 重组子。 v构建可对重组克隆进行选择的质粒载

14、体，这种质粒 载体具有直接选择标记并可赋予寄主细胞相应的表 型（荧光蛋白）。 v构建含有强启动子的表达型质粒载体，很多质粒载 体在多克隆位点的临近位置上带有外源启动子，插 入的外源基因可以表达相应的蛋白质。四、典型的质粒 载体 1. pBR322：pBR322是按照标准的载 体命名原则命名，p表示 质粒plasmid，BR分别是质粒的两位构建人 bolivar和rodriguez, 322指实验室编号。优点：v 具有较小的分子量: 经验表明为了避免DNA分子在纯化过程 中发生链的断裂，克隆载体最好不要超过10kb，pBR322不仅 易于分离纯化，而且即使克隆一段大小达6kb的外源DNA后，其重

15、组体分子的大小仍符合这一条件。v 有两种抗生素抗性基因，可作为转化子的选择性标记。当我们 把目的基因插入到抗性基因内部，抗性基因就会失去活性，即 不能进行抗性蛋白物质的合成，就为我们筛选提供一种标记。 v 具有较高的拷贝数，我们用氯霉素（壮观霉素）处理后 ，质粒的个数可达1000个。氯霉素可以抑制染色体DNA的复制（氯霉素可抑制核糖体的活性），所以当我们对 培养的菌体用氯霉素处理，松弛型质粒的复制起始功能 蛋白稳定，所以可以继续合成质粒，而宿主的复制起始 蛋白不稳定，半衰期短，所以细胞在不能分裂的情况下 ，质粒仍能复制，最后达到相当高的水平。 2、pUC质粒载 体：vpUC质粒载体：是由美国加

16、利福尼亚大学的专家构 建的。是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个 带有多克隆位点的LacZ基因，而发展成为具有双功 能检测特性的质粒载体。最常用的克隆载体，优点：v具有更小的相对分子量和更高的拷贝数。v在构建pUC质粒载体时仅留下pBR322的复制起始起 始位点和AMP抗性基因，分子大大减小，他的拷贝 数可以达到500700个/个细胞。v适合组织化学法检测重组子。有利于检测v具有多克隆位点，便于片断的插入。3、表达载体：4、穿梭质粒载体：v指的是一类由人工构建的具有两种不同复制起始位 点和选择标记可在两种不同的寄主中存活和复制， 并可携带外源基因在不同物种的细胞之间往返穿梭 的质粒载体。他们可以使得质粒可在不同宿主间进 行基因的转移，研究在不同的细胞中的克隆、表达 的调控功能。 v目前像大肠杆菌枯草芽孢的穿梭质粒，大肠酿 酒酵母，大肠动物等。五