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1、 激光诱变选育果胶酶高产菌株一、实验目的 1.了解果胶酶的应用领域。 2.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。 3.通过激光诱变技术筛选出高产果胶酶的菌株。 二、实验设计简介以腐烂的苹果、橘子、柚子和山楂等水 果为材料，分离筛选出一株产果胶酶的高产菌 株，采用波长632.8 nm，功率为11.5 mw的He -Ne激光对其进行诱变，结果得到果胶酶产生 时间早、活性强的优良菌株。有望用于果胶酶 的生产。实验设计背景介绍 一、背景简介 果胶酶(Pectinase)是指分解果胶类物质的多 种酶的总称，在食品加工、饲料加工、造 纸、环境保护和诱导植物抗病等方面都有 很大的应用价值。果胶酶可源于动物、植
2、 物和微生物。但动植物来源的果胶酶产量 低且提取困难，不能满足生产的需要，而 微生物则因其生长快速等特点成为果胶酶 的主要来源。自然界产果胶酶的菌株很多 ，据报道已有40多种，主要有曲霉属 (Aspergillus）、青霉属(Penicillinum)、侧孢 酶属(Sporotrichum)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)及某些兼性厌氧细菌等。这 些微生物所产果胶酶的活力大小各不相同， 筛选果胶酶高产菌株，仍是目前亟待研究的 课题。本文应用选择培养基分离、纯化产果 胶酶菌株，通过激光诱变，筛选出酶活力高 而且稳定的产果胶酶菌株，为今后的进一步 研究应用奠定了基础。果胶酶的应用一、
3、一、食品行业的应用 果胶酶与葡萄酒果胶酶与葡萄酒 法国干邑白 兰地巴塞罗那玫瑰红南非席拉主要内容 果胶酶的简介 影响果胶酶作用的主要因素 果胶酶在葡萄酒酿造中的运用 葡萄酒的功能果胶酶简介果胶酶是现代葡萄酒酿造中的重要辅料 ，大 多数是由黑曲酶 (Aspergillus 11增OT) 经特殊工艺制成的液体果胶酶或固体果胶 酶。葡萄酿酒中常用的果胶酶通常是复合 果 胶酶，含有果胶裂解酶，果胶酯酶和聚 半乳糖醛酸酯酶(Polygalacturonases，PG) 等。影响果胶酶作用的主要因素一.葡萄状态和处理手段对果胶酶作用的影响： (1)不同葡萄品种所含果胶种类和数量会有所差异， 如玫瑰香葡萄的
4、果胶含量显著高于霞多丽葡萄 ， 因此前者比后者澄清难度更大 。 (2)即使是相同葡萄品种，因为成熟度和地理环境的 不同，果胶 酶 的处 理 效果也会有所差异。例 如同样是赤霞珠，采用果胶酶处理后，产于炎热 智利美宝谷的酒样，其色度较对照组提高比例高 于相同处理的法国波尔多酒样。 (3)受灰绿葡萄孢霉菌侵染的葡萄，在侵染后所释放 出的大量葡聚糖会加大果 胶酶澄清难度。(4)在萄前处理和发酵过程中，由于采摘方式 、果 实运输、除梗率、压榨技术和浸渍强度的不同,葡 萄受到的损坏程度也有所不同。 二.处理介质环境对果胶酶作用效果的影响 :（1）温度对果胶酶活性的影响很大，从图中可以 看出该果胶 酶活性
5、的理想温度为45，但对葡萄 酒酿造而言，此温度是不适宜的。通常葡萄酒酿 造的理想温度为 1 43 2之 间 ，而白葡萄酒 的发酵 温 度更 低 (1 420之间)，这对果胶 酶的活性影响很大。通常在低温条件下会产生两 个结果 ：一是 葡萄汁的粘度增加会降低固体物 质的沉降速度；二是果胶酶活性下降。（2）对大部分果胶酶而言 ，最理想的pH值 是45左右 (图6)，而这个pH值在葡萄汁中 基本不可能出现 。通常,果胶 酶作用葡萄汁 或酒 的pH值 介于2.93.5之间.不同的pH值 ，对果胶酶活性的影 响很 大 (图6)。如果 pH值过低 (HpHO05)。 发酵刚开始时，由于孢子还处于萌发状态，
6、代谢产 物的分泌较少，粗酶液的pH较高，但随着发酵时 间的延长，从发酵3 h开始，粗酶液的pH在441 566之间变化，表明该果胶酶是在酸性条件下 起作用的，是一种酸性果胶酶。讨论 自然界产果胶酶的菌种很多，但采集的样品 中常含有多种多样的微生物，其产酶的性能差异 很大，所需要的目的菌种含量很少，为此，需要通 过选择一定的增殖培养基并控制一定培养条件而 提高分离所需菌株的筛选机率。本试验采用刚果 红平板培养基作为筛选培养基，并以透明圈与菌 落直径之比(HC)比较产酶能力，获得5株具有 产果胶酶活性的菌株，经鉴定分别为黑曲霉、青 霉、根霉、绿色木霉和米曲霉，均在目前已经报道 的产果胶酶种类范围内
7、，5种真菌的产酶能力大 小不同，本试验选取产酶能力最强的黑曲霉作为 出发菌做进一步的诱变筛选。发酵时间，h Fermentation time 图l诱变菌株和出发菌株酶活力曲线 FIGl The cnrve of the enzyme activities of the induced strain and the original strain酵时间h Fermentation time 图2诱变菌株和出发菌株发酵过程pH变化曲线 Fig2 The cnrve of the pH in the fermatation process of the induced strain and the
8、 original strain 微生物自发突变率非常低，一般为10叫 10-10，为了获得高产、优质和低耗的菌种，常常 通 过外界物理、化学及生物因子等因素的改变诱发 基因突变，从而引起微生物的遗传变异。物理 因子以其安全、设备简单、操作方便、价格低廉 和 诱变率高等优点而受到人们的关注910，其中 激 光诱变育种为主要研究方向之一。 彭益强等n1 利用激光诱变成功筛选出高产植酸酶黑曲霉菌 株”ASP2L211：，比原始菌株的植酸酶活力提高 了375倍。赵萌萌等12利用He-Ne激光诱变钝 顶螺旋藻IS，筛选出生长快、富含胡萝b素或蛋 白质的藻种。本试验采用波长6328 Dm，功率为 115
9、 mw的He-Ne激光诱变，使黑曲霉的生长 特性和产酶特性均发生变化。辐照时间在30 rain以内，可使其增殖加快，且随时间延长，其菌 落数增加。同时，可使其产酶的时间提前，产酶量 增加，表明试验选择的诱变剂量改变了其增殖和 产酶特性。pH测定显示，激光诱变前后，其生长 过程中pH未发生明显变化。辐照时间超过30 rain后，其增殖减慢，产酶活性反而降低，提示过 量的照射剂量则会破坏整个细胞膜，使细胞死亡， 同时刚萌发的孢子容易受到破坏导致死亡，从而 使细胞数量减少。 姜岩等】31运用He-Ne激光辐照热带假丝酵 母(Candidat ropieazlis)，考察了突变株的遗传稳 定性和降酚特
10、性。结果表明，经过激光辐照处理 的热带假丝酵母CT43降解2 000 mgL的苯酚 仅需要545 h，降解效率显著提高。本试验证 明，适当剂量的He-Ne激光辐照，可使黑曲霉的 产酶量提高100，且保持了稳定的产酶活力。 这为进一步研究产果胶酶微生物的和微生物诱变 育种提供了有利的试验依据。注意事项pH211型HANNA酸度计的注意事项不能用蒸馏水、去离子水、纯水等浸泡电极 如果电极上有结晶盐出现，用蒸馏水漂洗，之 后就会消失 为避免损坏电极，仪器关机前应将pH电极从溶 液中取出。如果已经关机，在将电极放入保存 液之前，应将电极从仪器上取下来，用蒸馏水 冲洗后套上保护套 为减少阻塞，薄膜电极和
11、透析膜必须保持湿润 不干燥使用722光栅分光光度计的注意事项 1、为了防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室 盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命 2、取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃 面，而不能碰比色皿的光学表面。 3、比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤 ，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶 液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭 ，以免损伤它的光学表面。 使用血球计数板的注意事项 1、血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物 洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的 乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通 过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀
12、物. 若不干净,则必须重复清洗直到干净为止. 2、从吸管中吸出培养液进行计数之前，要将试管 轻轻震荡几下，这样使菌分布均匀防止菌沉淀， 提高计数的代表性和准确性 3、如果一个小方格中菌过多，难以数清，应当对 培养液进行稀释，以便于菌的计数使用电泳槽的注意事项 1.电泳槽通电进入工作状态后，禁止人体接 触电极、电泳物及其它可能带电部分，也 不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断 电，以免触电。同时要求仪器必须有良好 接地端，以防漏电。 2.仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导 线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内 部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导 致仪器损坏。 配置培养基时的注意事项 1、培养
13、基配方的选定 2、培养基的制备记录 3、培养基成分的称取 4、培养基各成份的混合和溶化 5、培养基pH的初步调正 6、培养基的过滤澄清 7、培养基的分装 8、培养基的灭菌 9、培养基的质量测试 10、培养基的保存 1、培养基配方的选定 同一种培养基的配方在不同著作中常会有 某些差别。因此，除所用的是标准方法， 应严格按其规定进行配制外，一般均应尽 量收集有关资料，加以比较核对，再依据 自己的使用目的，加以选用，记录其来 源。 2、培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养基 名称，配方及其来源，和各种成份的牌号 ，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日 期和制备者等，记录应复制一份，原
14、记录 保存备查，复制记录随制好的培养基一同 存放、以防发生混乱。 3、培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意 防止错乱，最好一次完成，不要中断。可 将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配 方面军做出记号，并将所需称取的药品一 次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即 移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行 一次检查。4、培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得 为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌 不易生长。最好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或 大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶 化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时
15、扰动、以防焦 化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制 备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分 完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化 其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中， 因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。5、培养基pH的初步调正 因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变 化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH 的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低 pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因 此，对这个步骤，操作者应随时注意探索 经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证 培养基的质量。PH调整后，还应将培养基 煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出
16、。6、培养基的过滤澄清 液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉 淀，因此 ，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要 求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇 或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。 琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间 夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆 等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过 滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即 将冷却至5560C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量 不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入12个鸡蛋 的蛋白，强力振摇35分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121C 加热20分钟、取出趁热以
