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1、1破解呼吸道感染病原学诊断 的困境：需要你我他王 辉北京大学人民医院检验科 Email：L.CN.MKT.GM.04.2016.50592内 容n 呼吸道感染病原学n 困境和挑战n 可能的破解之道2王辉-实验诊断学3The Three Most Important The Three Most Important Elements in Practicing Elements in Practicing MedicineMedicineWilliam Osler, The Principles and Practice of Medicine, 1892Diagnosis! Diagnosis
2、! Diagnosis! Medicine is a science of uncertainty and an art of probability. 最重要的是不要看远方模糊的事，而是做好手 头清楚的事4欧洲流调：CAP的主要病原体病原体检出率(%)一项1996年11月至2008年7月在西班牙进行的CAP流调研究，纳入3,524例CAP患者(15%门诊患者 ,85%住院患者) ，其中1,463例患者病原学呈阳性反应。Cillniz C, et al. Thorax. 2011;66(4):340-346. 肺炎链球菌和非典型病原体是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=14635我国C
3、AP的主要致病菌入选2003年12月至2004年11月中国7个城市12个中心的665例CAP患者并进行病原体检测 2006年我国CAP的大型流调研究显示：肺炎支原体是我国CAP的最主要致病菌，其次为肺炎 链球菌1 在我国已经完成的另两项全国多中心成人CAP调查中，肺炎支原体感染的比例分别达到了 20.7%和38.9%，均已超过了肺炎链球菌(分离率分别为10.3%和14.8%)，成为成人CAP最常 见的致病原2,3 混合感染在社区呼吸道感染中占有重要地位，以细菌合并非典型病原体混合感染居多11.刘又宁 陈民钧 赵铁梅等. 中华结核和呼吸杂志.2006;29(1):3-8； Liu Y et al
4、. BMC Infectious Diseases. 2009;9:31. 3. Tao LL et al. Chin Med J (Engl). 2012;125(17):2967-2972.6成人病毒性肺炎发病率高，但长期被忽视n每年新发病毒性肺炎约200万例，其中成人和儿童各100万例n10项成年人CAP综述（共2910例），病毒性肺炎占22%Jennings LC , et al. Thorax 2008; 63:42-8. Ruuskanen O. Lancet 2011;377:1264- 75.6病毒科病毒种核酸类型正粘病毒科流感病毒单股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、
5、腮腺炎病毒、副流感病 毒、人类偏肺病毒单股RNA披膜病毒科风疹病毒单股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒的部分型别单股RNA腺病毒科腺病毒双股DNA冠状病毒科人类冠状病毒、SARS冠状病毒单股RNA疱疹病毒科单纯疱疹病毒、带状疱疹、EB和CMV双股DNA细小病毒科人类博卡病毒单链DNA呼肠孤病毒科呼肠孤病毒（1，2，3，4型）双链RNA7Pathogen identifiedPatients n (%)Respiratory Viruses262 (27.5)Influenza virus A94 (9.9)Human rhinovirus41 (4.3)Adenovirus40
6、 (4.2)Human metapneumovirus17 (1.8)Parainfluenza virus type 116 (1.7)Parainfluenza virus type 314 (1.5)Parainfluenza virus type 211 (1.2)Influenza virus B6 (0.6)Human enterovirus5 (0.5)Respiratory syncytial virus type A5 (0.5)Respiratory syncytial virus type B4 (0.4)Coronavirus OC43/HKU14 (0.4)Coron
7、avirus 229E/NL634 (0.4)Parainfluenza virus type 4 1 (0.1)Bocavirus0 (0.0)北京市成人CAP监测网：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本课题组牵头，联合北京市12家医院 n954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。 n重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。 JiuXin Qu. BMC Infect DIs 2015 online first 78上呼吸道标本类型及适应症8上呼吸道感染标本的采集9用拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁（3-5次）n 咽拭子的采集方法n 咽拭子的采集正确拿咽拭
8、子的方法错误拿咽拭子的方法上呼吸道感染标本的采集上呼吸道感染标本的采集11请患者头部保持不动，将拭子轻轻转动缓缓插入患者鼻腔，不要用力，当遇到阻力后即到达后鼻咽，停留数秒吸取分泌物，轻轻旋转取出拭子鼻 拭 子 标 本 的 采 集l病毒：选用涤纶或人造棉头塑料柄的拭子（如：聚丙烯纤维头），不能用藻酸钙 及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反应。脱脂棉拭子含有荧光物质，影响荧 光定量PCR结果l细菌：选用藻酸钙拭子。棉拭子、尼龙拭子可抑制百日咳博德特菌生长l采样后用于病毒检测的拭子，将拭子头浸入含一定量采样液的螺口管中，尾部弃 去，旋紧管盖，及时送检，如不能立即送检，可暂时储存于4冰箱内，严禁-2
9、0 冷冻。用于细菌检测的拭子插回采样管中或适宜的转运装置中，立即送检12上呼吸道感染标本的采集支原体保存液病毒采样拭子细菌采样拭子13下呼吸道标本类型及适应症1314下呼吸道标本类型及适应症14下呼吸道标本中， 痰27(1)：69-8622指南中强调：血培养至少送2套 在发热开始的24 h内进行血培养。 尽力保证在抗感染治疗前获得首份血培养标本。 同时经2个独立部位抽取血标本，此结果比单一部位的血培养更有临床意义。除外新生儿外，不建议只进行单套血培养（级）。 48-96 h后评估治疗效果，再次血培养不能单取1套，必须同时抽取2套标本（级）。 但对怀疑血管内的感染，则应该间隔一段时间取不同部位的
10、静脉穿刺抽 血，有助于诊断持续性菌血症（级）。Crit Care Med 2008 Vol. 36, No. 4；CLSI指南；英国指南23“双抽四瓶”，每瓶8-10ml标示“左侧”、“右侧”无菌体液 如胸水等手 册 宣 讲24痰标本在病原学诊断中面临的困难 CAP患者40%以上患者无法或及时产生痰 痰标本合格率较低，甚至送检唾液 培养：痰培养阳性率受多种影响因素影响且影响 极大，包括标本采集、运输、快速处理、合理应 用细胞学判断标准、前期无抗生素治疗、解释技 能 涂片革兰染色：最新数据表明，通过革兰染色辨 别1669个CAP住院病人合格标本，只有14%可 以辨别出主要形态类型24Americ
11、an Thoracic Society, Infectious Diseases Society of America. Guidelines on the Management of Community-Acquired Pneumonia in Adults, 2007:44 (Suppl 2)25痰标本不同外观25唾液脓痰粘液样痰带血痰2626标本质量评估痰涂片Garbage in！唾 液27一个小调查 随机调查中国15家医院2014年痰标本数据2728痰标本判读标准的比较2829合格痰标本：吞噬很重要29WBC内吞噬：葡萄球菌30涂片项目报告格式30普通细菌涂片及染色31痰培养标本质量
12、情况总数不合格不合格率儿科9777.78%内科2620188371.87%急诊64444168.48%血液科1501102067.95%外科39726767.25%妇产科231356.52%门诊26715056.18%ICU121555745.84%13家医院，痰标本合格率不足50%32粒缺患者肺炎的致病菌Curr Opin Pulm Med 2015, 21:26027133对于确诊IA：GM的诊断效能Curr Opin Pulm Med 2015, 21:26027134粒缺肿瘤肺炎：微生物学评价BAL是很好的诊断工具Curr Opin Pulm Med 2015, 21:26027135
13、恶性粒细胞减少患者的肺炎诊断 临床评估+微生物学评估+分子 微生物学评估：最可靠：从无菌部位分离or呼吸道分泌物中非共生菌 BAL是首选下呼吸道标本，越早采集越好，尤其使用抗 生素之前，但不能延误治疗 支气管活检（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培养不 优于BAL，且因为恶性粒细胞减少继发血小板减少使得 并发症风险高 分子方法：半乳甘露聚糖分子试验测试侵袭性曲霉病 （FDA已经批准）Scott E. Evans and David E. Ost, Pneumonia in the neutropenic cancer patient, Infectious diseases, 2015,21(
14、3):261-27136日均痰标本与BAL送检对比36BAL标本量要求 生理盐水总灌入量不少于100ml，分3-5份进行（ 标准为200-240ml，分4等份进行） 好的BAL标本，至少30%灌入液回收 10个菌落 培养后菌落计数： 相同形态菌落数103CFU/mL制作涂片 （细胞离心)血平皿巧克力平皿麦康凯平皿若用接种环密涂平板， 生长的菌落数量会低于实际数量。 但用 L 棒涂布平板计数， 定量培养结果更准确40肺泡灌洗液的涂片革兰染色 适量BALF标本进行细胞离心，经自然干燥、甲醇 固定或火焰快速固定3次，革兰染色 标本质量判断以扁平鳞状上皮细胞占全部细胞比 例1% 为合格标本 敏感度为1
15、04个细胞/mL，若每个油镜视野可见1 个或多个细菌，报告革兰染色形态及白细胞结果 ，提示此菌与活动性肺炎相关。401. Patrick RM. Manual of clinical microbiology. 9th ed. US: ASM Press, 2007: 307- 308 2. 中华人民共和国卫生行业标准下呼吸道感染细菌培养操作规范S.41肺泡灌洗液定量培养的意义 细菌性感染，浓度阈值104CFU/mL，低于阈值浓度 时，定植可能性大; 高于阈值时，感染可能性大。 真菌性感染，目前没有BAL的诊断性阈值。 丝状真菌也没有阈值。但丝状真菌在呼吸道分泌物 中的价值远大于酵母菌属。该类
16、菌在 EORTC /MSG 指南中有“临床诊断( probable diagnosis)”价值411. A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the American Society for Microbiology (ASM), 2013:57(15 August) 2. EORTC /MSG 王辉-感染医师培训42培养与涂片结果不符：重新读片培养与涂片结果不符：重新读片中华结核和呼吸杂志,2011,34(9)43哮喘患者：结晶和库什曼螺旋体王辉-感染医师培训44有意义的细菌浓度值（有意义的细菌浓度值（CFU/m
